论文摘要
脑胶质瘤是成人中枢神经系统最常见的恶性肿瘤。目前,胶质瘤的治疗手段主要包括手术治疗、放射治疗、药物化疗等,尽管近年来这些治疗措施已取得一定进展,但由于胶质瘤呈浸润性生长,且易于复发,疗效均不甚理想。化疗耐药的存在又进一步制约着恶性胶质瘤治疗效果。新的治疗手段如基因治疗等虽有望成为治愈胶质瘤的途径之一,但目前仍缺乏理想可靠的治疗靶标。因此寻找调控胶质瘤细胞恶性生物学行为和化疗耐药的分子靶标,明确其在胶质瘤耐药中的病理机制,已成为神经外科领域的研究重点和热点之一。本研究拟通过构建AKT2 shRNA慢病毒干扰载体并感染胶质瘤细胞株,研究AKT2在胶质瘤发生发展过程中可能起到的作用以及探讨AKT2与VM-26化疗敏感性的关系。实验共分为三个部分:第一部分AKT2基因RNA干扰慢病毒载体的构建及鉴定目的:构建AKT2 shRNA慢病毒表达载体,为后续实验研究提供依据。方法:表达载体酶切后进行胶回收载体片段,目的基因与载体片段同源重组后转化感受态细胞,用菌落PCR鉴定转化子,阳性克隆测序鉴定,质粒抽提,与无内毒素病毒包装质粒、膜蛋白表达质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒颗粒,测定慢病毒滴度。结果:PCR扩增和测序结果均证实,插入序列完全正确,包装病毒产生病毒悬液的滴度为2.97×108TU/ml。结论:成功构建了携带AKT2基因的慢病毒载体,为研究其在胶质瘤细胞中的生物学功能及其对胶质瘤化疗敏感性的影响奠定基础。第二部分AKT2 shRNA转染胶质瘤细胞株U87及其对细胞增殖、凋亡的影响目的:研究通过慢病毒载体靶向抑制AKT2基因表达对胶质瘤细胞株U87生长、增殖、凋亡的作用。方法:利用AKT2 shRNA慢病毒干扰载体感染U87细胞株, MTT法测定细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期改变,AV/PI染色测定细胞凋亡,RT-PCR和Western blot测定转染后细胞株U87中Bcl-2、Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平变化。结果:转染AKT2-shRNA可有效降低U87细胞株内的AKT2表达。AKT2低表达的U87细胞株同对照组相比,其增殖明显降低（P<0.05）。经流式细胞仪检测,转染AKT2 shRNA后U87的凋亡率较对照组明显增加（p<0.01）,细胞周期停滞在G0/G1期, Bcl-2表达明显降低,而Caspase-3mRNA表达明显增加。在Western blot实验中蛋白表达改变的趋势与上述基因mRNA改变的趋势一致。结论:AKT2 shRNA可抑制胶质瘤细胞株的增殖,并导致肿瘤细胞凋亡增加。第三部分shRNA沉默AKT2对U87、U251胶质母细胞瘤细胞株化疗药物敏感性的影响目的:研究AKT2 shRNA对胶质母细胞瘤细胞系U87MG和U251MG化疗药物敏感性的影响。方法:利用AKT2慢病毒干扰载体感染U87、U251细胞株,建立shRNA沉默AKT2基因表达水平的U87、U251胶质瘤细胞系。上述胶质瘤细胞系与不同浓度VM-26共培养三天,MTT法测定第三天细胞抑制率,计算IC50。结果: U87、U87-GFP（干扰阴性对照）、U87-shRNA（干扰组）3组AKT2不同表达水平的U87MG IC50值分别为6.42±0.38μg/ml、6.46±0.42μg/ml、3.95±0.22μg/ml;U251、U251-GFP阴性对照、U251-shRNA（干扰组）3组不同AKT2表达水平的U251MG IC50分别为:7.27±0.53μg/ml、7.30±0.78μg/ml、4.22±0.51μg/ml。结论:AKT2表达与U251、U87胶质瘤细胞株对VM-26的敏感性存在相关性,shRNA沉默AKT2表达能提高脑胶质瘤细胞株对化疗药物敏感性。