论文摘要
本实验室前期工作中从损伤大鼠脊髓的cDNA文库中筛选到一条与脊髓损伤修复密切相关的新基因,并将其命名为脊髓损伤修复相关基因6（9spinal cord injury and repair related gene No.69,scirr69）。生物信息学分析该基因位于大鼠4号染色体,其mRNA由12个外显子组成,编码一个长度为521aa的蛋白质。在结构上,SCIRR69与已报道的ATF6、OASIS等内质网应激相关的跨膜转录因子非常相似,均属于Ⅱ型跨膜蛋白,并且在其胞浆区均具有一个bZIP结构域。体内、体外实验均证实,SCIRR69具有转录因子功能,其转录活性位于N端1-60个氨基酸。由于SCIRR69是新发现的蛋白质,目前尚无商品化抗体销售,我们实验室已制备了SCIRR69的单克隆抗体,在前期研究中起到了重要作用。考虑到蛋白磷酸化在转录因子的活性调节过程中发挥的关键作用,我们要研究SCIRR69活化和入核的调节机制,以及作为转录因子的下游的转录激活功能,制备SCIRR69高敏感度的特异性的抗体尤其是潜在的磷酸化位点的抗体是重要的手段。我们用生物信息学的方法对SCIRR69蛋白上潜在的磷酸化位点和抗原表位进行了预测,并根据预测结果合成了两条包含潜在磷酸化位点的短肽S1:5-22aa和S2:86-101aa。利用这两种短肽作为免疫原,我们成功制备19株抗SCIRR69的单克隆抗体,其中包括1株磷酸化位点特异性单克隆抗体和18株非磷酸化位点特异性单克隆抗体。在非磷酸化位点特异性单克隆抗体中,我们选取效价较高的一株——mAb 4B4D3D6分别利用Western blot、免疫荧光、免疫沉淀以及质谱技术对其识别的靶分子进行了系统的鉴定,结果表明,该单克隆抗体可以特异性地识别天然状态和变性的SCIRR69分子,并且由于该抗体的表位位于SCIRR69分子的N端,因此可以同时用来检测SCIRR69全长分子和剪切体,从而为后续研究SCIRR69分子的剪切、入核、降解等机制提供条件。对于Ser19磷酸化位点特异性单克隆抗体,Western blot显示其仅能够识别全长的SCIRR69分子,而不能识别蛋白酶剪切后的SCIRR69分子,提示该位点的磷酸化状态可能在SCIRR69的活化过程中发生了改变。此外,我们发现除SCIRR69外,所制备的磷酸化位点特异性单克隆抗体还能够识别胞核蛋白Nucleolin,并能将其从细胞的蛋白提取物中免疫沉淀下来。由于SCIRR69分子在序列和结构上与OASIS等内质网应激分子非常相似,因此我们利用制备的针对SCIRR69的单克隆抗体对该分子在内质网应激条件下的表达和细胞内定位进行了研究。WB结果显示在内质网应激诱导剂Tg、Tm的存在下,PC12细胞中SCIRR69全长分子的表达明显增高,但其剪切体形式仅在Tg作用下有所增加。在细胞内定位方面,利用免疫荧光,我们发现在转染pEGFP-C1-SCIRR69后正常培养的细胞中,SCIRR69几乎全部分布于胞浆,一旦加入内质网应激诱导剂Tg和DTT,SCIRR69的细胞内定位即可发生较明显的改变:在Tg存在时,SCIRR69主要表现在向细胞核的转位,而在DTT刺激细胞0.5h后,则其细胞内定位的改变则主要表现在向细胞两极的迁移,也有部分向细胞核的移位。BiP是内质网中重要的分子伴侣,也是内质网应激活化的主要靶分子之一。以往研究表明,ATF6、OASIS等转录因子活化后均可通过BiP基因启动子上相应的顺式作用元件启动BiP基因的转录,其中ATF6主要作用于启动子上的ERSE元件,而OASIS则主要作用于启动子上的CRE元件。为了验证SCIRR69是否也能够激活BiP启动子的转录,我们从大鼠的基因组中扩增了不同长度的BiP基因启动子序列,其中较长的序列（-457至-29和-304至-29）同时含有完整的CRE元件和ERSE元件,较短的序列（-169至-29）则仅包含有3个ERSE元件。利用双荧光素酶报告基因检测系统,我们发现SCIRR69对上述三种启动子的序列均没有明显的激活作用。这提示SCIRR69的识别位点可能与已知ATF6、OASIS等转录因子的识别位点不同,其靶基因也需进一步确定。