论文摘要
目的克隆人蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）基因及构建真核表达重组体pcDNA3.1-hPTP1B,转染至猴肾成纤维细胞系（COS-7）,表达的重组融合蛋白用亲和层析法纯化,初步进行了酶活性及抑制剂的实验。方法通过设计5’端引物和3’端引物（分别含BamH,EcoRⅠ酶切位点）,取2型糖尿病人(BMI＞28kg·m-2)抗凝外周血,淋巴细胞分离液分离淋巴细胞。提取总RNA,以Oligo dT为引物,合成出cDNA第一链。以RT产物为模板,PCR扩增出PTP1B插入片段。酶切后定向导入pcDNA3.1/myc-His-B多克隆位点,构建真核表达载体pcDNA3.1-hPTP1B,转染COS-7细胞,G-418筛选2周后取细胞裂解上清液经Ni2+亲和层析柱纯化后,利用PTP1B水解特异性底物4-硝基苯基磷酸二钠盐（pNPP-Na2-Na2）的磷酸基团而产生颜色反应来测定PTP1B酶的活性。主要洲定:1.PTP1B活性与PTP1B浓度的关系;2.PTP1B活性与底物pNPP-Na2浓度的关系;3.PTP1B活性与反应温度的关系;4.特异性抑制剂钒酸钠（Na3VO4）抑制作用的浓度依赖关系及抑制类型的研究;5.常用胰岛素治疗药物吡格列酮和二甲双胍对PTP1B酶有无抑制作用的试探性研究;6.中药老鹰茶对PTP1B酶的抑制性作用和浓度依赖关系。结果从2型糖尿病患者外周血中扩增得到1301bp PTP1B cDNA全长序列,经双酶切鉴定及测序分析,表明hPTP1B已克隆到pcDNA3.1/myc-His-B中。RT-PCR和免疫印迹表明转染成功。抑制剂研究表明:1.rhPTP1B的活性随酶浓度底物浓度增加而增加;2.在35℃左右,rhPTP1B的活性最大;3.钒酸钠对PTP1B的抑制作用呈浓度依赖性增强,PTP1B酶活性随钒酸钠浓度增加而减少,双倒数作图显示,钒酸钠的作用机制可能为非竞争性抑制作用;4.常用治疗糖尿病药物二甲双胍和吡格列酮对PTP1B酶并无明显抑制作用,而老鹰茶的总黄酮粗提物（TFLC）对PTP1B有明显的抑制作用,且呈浓度依赖性增强。结论已成功构建了真核表达载体pcDNA3.1/myc-His-hPTP1B,稳定转染到COS-7细胞中并成功表达,纯化的rhPTP1B融合蛋白可用于抑制剂的研究。通过初步的抑制剂研究对影响PTP1B的活性的反应条件和一些抑制剂的抑制特点有所了解。
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