环氧合酶-2在大鼠重症急性胰腺炎及相关性肺损伤中作用机制的实验研究

论文摘要

研究背景急性胰腺炎是临床常见的急腹症,是多种病因引起胰酶激活,继以胰腺局部炎症反应为主要特征,伴或不伴有其他器官功能改变的疾病。急性胰腺炎常伴有全身炎症反应,约15%-30%发展为重症急性胰腺炎,病情进展迅速,常累及肺、肝、肾、心脏等全身多个重要脏器,导致全身炎症反应综合征,甚至全身多脏器功能衰竭,其病死率高达30%。因此,重症急性胰腺炎仍是目前常见的、严重威胁人类健康的重大疾病。急性肺损伤是重症急性胰腺炎早期常见的、也是最为严重的全身并发症,急性呼吸窘迫综合征是急性肺损伤的严重表现形式,也是重症急性胰腺炎病人早期死亡的主要病因,其病死率超过40%。有人认为重症急性胰腺炎及相关性肺损伤可以作为临床评价重症急性胰腺炎严重程度的标准之一,因此,如何防治重症急性胰腺炎病人并发急性肺损伤或急性呼吸窘迫综合征,对提高重症急性胰腺炎疗效、改善预后具有重要意义。迄今为止,重症急性胰腺炎及相关性肺损伤的病理生理机制,以及影响重症急性胰腺炎发生发展和结局的因素仍不非常清楚。积累的大量证据表明,胰腺实质中活化的单核巨噬细胞、中性粒细胞释放的TNF-α、IL-1和IL-6等多种促炎细胞因子不仅有助于启动急性胰腺炎局部炎症的形成和发展,而且也有助于导致全身炎症反应,促炎细胞因子的过表达加重了实验急性胰腺炎的严重程度;与此相反,IL-4、IL-10等抗炎细胞因子则可显著减轻了实验急性胰腺炎的严重程度。近来,前列腺素及源于前列腺素的炎症介质在介导急性胰腺炎全身炎症反应中的作用受到密切关注。环氧合酶（COX）是前列腺素合成的关键限速酶,包括两种类型:结构型COX-1和诱导型COX-2,COX-1是一种重要管家酶,产生的前列腺素主要维持生理功能;而COX-2是一种重要的前炎症介质,在绝大多数正常组织无表达,但可在包括急性胰腺炎在内的炎症疾病中过表达,提示COX-2在急性胰腺炎的形成和发展中起着重要作用。迄今,有关COX-2在重症急性胰腺炎及相关性肺损伤中的具体作用及机制尚不清楚。目的本研究旨在利用大鼠重症急性胰腺炎模型,探讨COX-2在重症急性胰腺炎及相关性肺损伤中的可能作用及机制。全文分两部分:第一部分,主要探讨重症急性胰腺炎大鼠有关炎症介质的变化,COX-2在胰腺组织中的表达及COX-2表达与胰腺损伤程度的相关性;第二部分,用COX-2高选择性抑制剂Celecoxib预处理重症急性胰腺炎大鼠,观察预处理大鼠胰腺和肺组织损伤程度的变化,探讨Celecoxib的可能作用机制。方法健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠,体重250±30g,随机分成:正常组（N组）:开腹后轻轻翻动十二指肠和胰腺,关腹;模型组（SAP组）:以5%牛磺胆酸钠（1.0ml/kg）逆行胰胆管注射,诱导重症急性胰腺炎模型;治疗组（T组）:在大鼠重症急性胰腺炎模型诱导前2小时,以30mg/kg.d剂量给予灌胃Celecoxib预处理。各组分别于术后3小时、6小时、12小时处死大鼠,收集血清、胰腺和肺组织标本。测定血清淀粉酶活性;ELISA法测定血清TNF-α、IL-6水平;放免法测定血浆和肺组织中TXB2与6-keto-PGF1a浓度;分光光度计测定肺组织中髓过氧化酶（MPO）活性;肺水肿严重程度以肺组织湿干重比表示;制作胰腺和肺组织标本,HE染色用于胰腺和肺组织损伤的病理学评价,免疫组织化学方法测定胰腺和肺组织COX-2表达及胰腺组织NF-κB表达;RT-PCR与Western-Blot法检测肺组织中COX-2mRNA和COX-2蛋白的表达。结果第一部分与正常组比较,牛磺胆酸钠诱导后各时间点（3h、6h、12h）血清淀粉酶活性、TNF-α与IL-6水平、血浆TXB2与6-keto-PGF1a浓度等均显著升高,胰腺损伤（水肿、出血、坏死和炎症）病理学评分均显著增加（P<0.05）,大鼠24小时死亡率为100%。因此,在本研究中,我们采用5%牛磺胆酸钠逆行胰胆管注射成功地建立了重症急性胰腺炎大鼠模型。本研究发现,正常胰腺组织中未见COX-2表达,牛磺胆酸钠诱导后的SAP大鼠3至12小时胰腺组织中均可观察到COX-2过表达,并于6小时达到高峰。COX-2蛋白的表达水平在各时间点均与胰腺组织损伤程度显著相关（P<0.05）。第二部分使用COX-2高选择性抑制剂Celecoxib预处理后显著降低了SAP大鼠血清淀粉酶活性和TNF-α水平（P<0.05）,改善了腹水性状;肺组织TXB2/6-keto-PGF1a比值在6小时、12小时较SAP组显著减低（P<0.05）。无论是肉眼还是光镜下观察,Celecoxib预处理均显著减轻了重症急性胰腺炎大鼠胰腺和肺组织损伤程度,表现为胰腺和肺组织损伤病理学评分,肺组织湿干重比与髓过氧化酶活性（MPO）显著下降（P<0.05）。免疫组化显示,正常组大鼠肺组织COX-2无表达,在牛磺胆酸钠诱导后SAP大鼠肺组织COX-2表达显著上调,6小时达到高峰,并持续至12小时;正常组大鼠胰腺组织NF-κB无表达,在牛磺胆酸钠诱导后SAP大鼠胰腺组织NF-κB表达显著上调,3小时即达到高峰,并持续至12小时;Celecoxib在各时间点均显著降低了SAP大鼠胰腺组织NF-κB、COX-2和肺组织COX-2蛋白的表达水平（P<0.01）。RT-PCR和Western-blot检测结果显示,正常组大鼠肺组织COX-2mRNA与COX-2蛋白表达极低,在牛磺胆酸钠诱导后SAP大鼠肺组织COX-2mRNA与COX-2蛋白表达显著增强（P<0.01）,于6小时达到高峰;Celecoxib在各时间点均显著降低了SAP大鼠肺组织COX-2mRNA与COX-2蛋白表达水平（P<0.05）。结论本研究结果清楚表明,COX-2是SAP早期反应基因,在重症急性胰腺炎及相关性肺损伤的发生发展中起着关键的作用。COX-2的作用机理可能与其启动炎症反应,产生大量前列腺素类物质,导致胰腺与肺微循环障碍有关。Celecoxib能抑制COX-2基因的表达,具有显著改善实验性大鼠重症急性胰腺炎及相关性肺损伤的作用。Celecoxib改善SAP大鼠胰腺和肺损伤作用的可能分子机制:①抑制TNF-α产生,减少中性粒细胞在组织内的滞留,并促进其凋亡,从而减轻血管内皮细胞损伤和抑制中性粒细胞的功能;②抑制胰腺和肺组织中TXA2和PGI2的释放,促进TXA2/PGI2的平衡,改善微循环。③抑制NF-κB的激活,阻断炎症介质的级联释放,抑制过度炎症反应。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 中英文对照
• 正文
• 第一部分 环氧合酶-2在重症急性胰腺炎大鼠胰腺组织中表达的实验研究技术线路
• 前言
• 材料与方法
• 1.1 实验动物及饲养
• 1.2 主要实验试剂和设备
• 1.3 实验方法
• 1.4 检测项目与方法
• 1.5 统计学处理
• 结果
• 2.1 血清淀粉酶水平
• 2.2 血清TNF-α浓度
• 2.3 血清IL-6浓度
• 2和6-keto-PGF_1α浓度及TXB₂/6-keto-PGF_1α比值'>2.4 血浆TXB₂和6-keto-PGF_1α浓度及TXB₂/6-keto-PGF_1α比值
• 2.5 胰腺的病理形态学改变
• 2.6 胰腺组织COX-2蛋白表达水平
• 2.7 COX-2表达与胰腺组织损伤程度的相关性
• 2.8 大鼠24h死亡率及平均存活时间
• 讨论
• 结论
• 第二部分 Celecoxib对大鼠重症急性胰腺炎及相关性肺损伤的作用机制技术线路
• 前言
• 材料与方法
• 1.1 实验动物及饲养
• 1.2 主要试剂和设备
• 1.3 实验方法
• 1.4 检测项目与方法
• 1.5 统计学处理
• 结果
• 2.1 大鼠腹水性质和量的变化
• 2.2 血清淀粉酶水平
• 2.3 血清TNF-α浓度
• 2和6-keto-PGF_1α浓度及TXB₂/6-keto-PGF_1α比值'>2.4 肺组织TXB₂和6-keto-PGF_1α浓度及TXB₂/6-keto-PGF_1α比值
• 2.5 肺组织湿干重比测定
• 2.6 肺组织髓过氧化物酶（MPO）活性测定
• 2.7 胰腺、肺组织损伤的病理学改变
• 2.8 Celecoxib对SAP大鼠胰腺与肺组织中COX-2蛋白表达的变化
• 2.9 胰腺组织中NF-κB蛋白表达的变化
• 2.10 肺组织中COX-2mRNA表达的变化
• 2.11 肺组织中COX-2蛋白的表达
• 2.12 多元相关性分析
• 讨论
• 一、Celecoxib对SAP大鼠胰腺及相关肺损伤具有显著的改善作用
• 二、Celecoxib改善SAP相关肺损伤的可能作用机制
• 结论
• 附图
• 参考文献
• 综述
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果