论文摘要
研究背景与目的:成纤维细胞是多种具有明显异质性和独特表型的成纤维细胞亚群的总称,不同的亚群具有不尽相同的生物学功能。成纤维细胞是维持胶原代谢平衡的主要细胞,在器官纤维化、创伤愈合中发挥关键作用。胶原降解代谢有两条途径,即胞内途径和胞外途径。成纤维细胞吞噬降解胶原是主要的胞内途径,也是组织器官更新和创伤修复的重要机制。一些纤维化性疾病,甚至肿瘤转移均与胶原胞内降解代谢紊乱有关。在体外培养的牙龈成纤维细胞中,具有吞噬胶原能力的细胞亚群所占比例最多可达80%。但至今未见有关成纤维细胞胶原吞噬（Collagen Phagocytic Subpopulation of Fibroblast CPSF）和非吞噬亚群（non-Collagen Phagocytic Subpopulation of Fibroblast nCPSF）分子特征的研究报道,其难点在于尚无法将CPSF和nCPSF分离,既往有关成纤维细胞的大量研究均是以混合成纤维细胞群为研究对象,影响了结果的精确性。本研究尝试通过CPSF和nCPSF胶原吞噬功能的差异建立分离方法。通过生物芯片技术和real-time PCR筛选、验证两者差异表达基因,并采用免疫荧光技术检测其蛋白在CPSF和nCPSF中的表达,寻找CPSF和nCPSF具有特征性的分子标志物。研究分子标志物在成纤维细胞吞噬胶原过程中的作用,并以标志物为靶分子,探讨建立新的细胞分离方法的可行性,为进一步研究成纤维细胞亚群奠定基础。方法:1.取健康志愿者的正常牙龈,采用组织块培养法获得体外培养的成纤维细胞。将可溶性Ⅰ型鼠尾胶原蛋白或鼠IgG包被FITC-LB,按细胞:微球=1:4比例将已制备好的COL-FITC-LB或IgG-FITC-LB溶液分别加入各实验组细胞内,检测成纤维细胞0.5、1、2、4、6、12、24h对IgG-FITC-LB和COL-FITC-LB的吞噬率。2.体外培养的成纤维细胞加入COL-FITC-LB 6h后,上流式细胞仪分选CPSF和nCPSF。体外培养分选后的CPSF和nCPSF,倒置显微镜下观察其生长情况,每次传代前检测牙龈成纤维细胞4h胶原吞噬率。3.将来自3位健康志愿者体外培养的牙龈成纤维细胞等量混合,转至待测管内。流式细胞仪分选CPSF和nCPSF。分别提取CPSF和nCPSF总RNA,通过人类基因组U133A 2.0芯片技术筛选获得CPSF和nCPSF差异基因表达谱。4.依据与细胞吞噬胶原过程的相关性,从差异基因表达谱中挑选出胶原吞噬功能相关基因,并采用Real-time PCR进一步验证。5.通过半定量RT-PCR和免疫荧光定位技术,分别检测4健康志愿者的CPSF和nCPSF中整合素α2、uPARAP的mRNA和蛋白表达,比较研究整合素α2和uPARAP在成纤维细胞胶原吞噬过程中的作用,探讨以uPARAP为靶分子分离CPSF的可行性。结果:1.成纤维细胞在0.5h内即开始吞噬胶原及IgG-FITC-LB,IgG-FITC-LB吞噬率在1h达到峰值后保持稳定;而COL-FITC-LB吞噬率在4h接近峰值,随后保持稳定;6h之后成纤维细胞对COL-FITC-LB的吞噬率比IgG-FITC-LB吞噬率高10倍以上。2.体外培养分选后的CPSF 24h,未见贴壁,逐渐死亡。nCPSF培养6h后,大部分细胞贴壁,并正常生长增殖、传代。第1次传代前4hCOL-FITC-LB吞噬率仅12.17%,第2次传代前COL-FITC-LB吞噬率升至34.76%,第3次传代前COL-FITC-LB吞噬率达60.65%,接近未经分选的混合细胞群的COL-FITC-LB吞噬率。3.从18400个转录本（代表14500个明晰的基因）中筛选出CPSF和nCPSF差异表达基因共17个,其中上调表达基因12个,下调表达基因有5个。4.从12个上调表达基因中,挑选出与胶原吞噬功能可能相关的3个候选基因,即uPARAP、CYBB和HOOK1,通过Real-timePCR扩增后比较其差异表达相对量。结果显示,CPSF中uPARAP表达量为nCPSF的2788倍;CPSF中CYBB表达量为nCPSF的0.85倍;CPSF中HOOK1表达量为nCPSF的1.96倍。5.体外培养的4例正常牙龈成纤维细胞均有同样的表现:CPSF中uPARAP mRNA表达显著,而在nCPSF中uPARAP mRNA无表达。在CPSF和nCPSF中整合素α2mRNA均有显著的表达。6.体外培养的4例正常牙龈成纤细胞中,几乎所有细胞均表达整合素α2蛋白,而uPARAP蛋白只在部分细胞中表达,小部分细胞不表达。uPARAP蛋白在CPSF中表达,在nCPSF中基本不表达,但整合素α2蛋白在CPSF和nCPSF中均有明显的表达。结论:1.利用CPSF和nCPSF在胶原吞噬功能上的差异,联合应用COL-FITC-LB吞噬技术和FCM细胞分离技术能够将两者成功分离,建立了分离CPSF和nCPSF的新方法,也为探讨CPSF和nCPSF的生理和病理学意义提供了新的技术平台。2.CPSF和nCPSF最主要的差异表达基因是uPARAP。CPSF细胞表面表达uPARAP蛋白分子,而nCPSF不表达,uPARAP是CPSF的功能分子标志物,可用于鉴别或分离CPSF,为进一步研究CPSF和nCPSF的表型特征、以及两者的相互关系奠定了实验基础。3.uPARAP是成纤维细胞的主要胶原受体,对成纤维细胞胶原吞噬功能具有重要影响,是治疗胶原代谢疾病新的候选靶分子之一。