表皮生长因子受体（EGFR）和Fms样酪氨酸激酶（FLT3）基因在毕赤酵母中的表达

论文摘要

表皮生长因子受体（EGFR）和Fms样酪氨酸激酶（FLT3）是两种重要的具有酪氨酸激酶活性的信号转导的跨膜受体。EGFR信号途径与肿瘤的发生、发展有着密切的关系。Fms样酪氨酸激酶（FLT3）在多种白血病的患者中非正常表达，它们在促进诊断与治疗肿瘤上具有非常重要的作用。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是一种高效的外源蛋白基因表达系统，具有高表达、高稳定、高分泌、容易放大和成本低等优点，所以，选择毕赤酵母表达系统来表达EGFR和FLT3。EGFR和FLT3的基因片段分别克隆到pPICZαA中，并通过测序鉴定。构建好的pPICZαA-EGFR和pPICZαA-FLT3分别经过SacⅠ和BstXⅠ进行线性化后，电转化X33毕赤酵母中。用抗生素zeocin筛选阳性克隆，并筛选出多拷贝的菌株。筛选高表达菌株并优化培养条件，例如：诱导的时间，甲醇的诱导浓度，以及磷酸钾缓冲液（pH6.0）的影响。pPICZαA-EGFR/X33和pPICZαA-FLT3/X33经甲醇的诱导表达后，在培养液的上清液中有目标蛋白质的表达。经过SDS-PAGE电泳，EGFR分子量大小约为68 kDa，FLT3分子量大小约为58 kDa。EGFR的培养条件为28℃，诱导时间为84h，甲醇的诱导浓度为1.5％的条件下，表达量较高；FLT3的培养条件为28℃，诱导时间为96h，甲醇的诱导浓度为1.5％的条件下，表达量较高。重组蛋白经过硫酸铵沉淀浓缩后，过Ni-NTA亲和层析柱纯化EGFR和FLT3。

论文目录

• 目录
• 中文摘要
• Abstract
• 综述
• 前言
• 1 表皮生长因子（EGFR）
• 1.1 EGFR的结构特性
• 1.2 EGFR的研究意义
• 2 Fms样酪氨酸激酶（FLT3）
• 2.1 FLT的结构
• 2.2 FLT的功能
• 2.3 FLT研究意义
• 3 毕赤酵母表达系统
• 3.1 毕赤酵母表达系统的特点
• 3.2 毕赤酵母及表达载体
• 3.3 毕赤酵母诱导表达的调控机制
• 实验材料
• 1 菌株和质粒
• 2 试剂
• 3 PCR反应试剂及酶
• 4 仪器和设备
• 实验方法
• 1 克隆质粒的构建
• 1.1 引物的设计
• 1.2 基因片段的扩增
• 1.3 质粒的提取
• 1.4 双酶切和连接
• 1.5 转化大肠杆菌
• 1.6 阳性重组子的筛选与鉴定
• 2 表达质粒的构建
• 3 毕赤酵母中表达重组蛋白质
• 3.1 制备pPICZαA-EGFR和pPICZαA-FLT
• 3.2 酵母感受态的制备
• 3.3 电击转化
• 3.4 菌落PCR鉴定
• 3.5 筛选高拷贝菌株
• 3.6 蛋白质的诱导表达
• 3.7 用SDS-PAGE鉴定重组蛋白的表达
• 3.8 蛋白质的初步纯化
• 3.9 蛋白质的亲和纯化
• 结果与分析
• 1 基因片段的扩增
• 2 pBSSK-EGFR和pBSSK-FLT的构建
• 2.1 pBSSK-EGFR的双酶切鉴定
• 2.2 pBSSK-FLT的双酶切鉴定
• 3 构建pPICZαA-EGFR和pPICZαA-FLT
• 3.1 pPICZαA-EGFR双酶切鉴定
• 3.2.pPICZαA-FLT的双酶切鉴定
• 3.3 pPICZαA-EGFR和pPICZαA-FLT的测序分析结果
• 4 酵母菌落PCR鉴定
• 5 pPICZαA-EGFR/X33和pPICZαA-FLT/X33的诱导表达
• 5.1 筛选pPICZαA-EGFR/X33高表达的菌株
• 5.2 筛选pPICZαA-FLT/X33高表达的菌株
• 5.3 pPICZαA-EGFR/X33不同时间的诱导表达
• 5.4 pPICZαA-FLT/X33不同时间的诱导表达情况
• 5.5 pPICZαA-EGFR/X33在含有磷酸钾缓冲液和不含缓冲液的表达
• 5.6 pPICZαA-FLT/X33在含有磷酸钾缓冲液和不含缓冲液的表达
• 5.7 pPICZαA-EGFR/X33在不同甲醇浓度下,蛋白质的诱导表达
• 5.8 pPICZαA-FLT/X33在不同甲醇浓度下,蛋白质的诱导表达
• 5.9 pPICZαA-EGFR/X33的亲和纯化
• 5.10 pPICZαA-FLT/X33的亲和纯化
• 讨论
• 1 表达质粒的构建
• 2 菌落PCR
• 3 诱导表达情况
• 总结与展望
• 参考文献
• 论文发表
• 致谢