肺炎克雷伯氏菌荚膜免疫活性物质的研究

论文题目: 肺炎克雷伯氏菌荚膜免疫活性物质的研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 发酵工程

作者: 张燕

导师: 杜连祥

关键词: 肺炎克雷伯氏菌,荚膜免疫活性物质,发酵,制备,荚膜多糖,免疫调节,细胞凋亡,一级结构

文献来源: 天津科技大学

发表年度: 2005

论文摘要: 论文采用临床分离的具有国内肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）血清型流行特征的Kp CGMCC No.1000株,对其荚膜免疫活性物质CIA的微生物高效表达条件,制备工艺以及生物活性进行了系统研究,分离纯化了荚膜多糖CPS,以慢性髓系红白血病K562细胞为模型,对CPS诱导肿瘤细胞凋亡进行了初步研究,并对其一级结构进行了表征。 首先建立了对Kp荚膜免疫活性物质的间接ELISA检测法,该法的检测灵敏度为0.031μg/mL,线性检测范围为2.5μg/mL～30.0μg/mL,其精密度和准确度均能满足检测方法的要求,适用于Kp荚膜免疫活性物质样品的大批量、快速检测;同时建立了Kp全菌ELISA检测方法,该法与菌体荚膜免疫活性物的间接ELISA法的检测结果呈正相关性,为发酵工艺优化提供了重要评价指标。 确立了最适Kp生长和CIA表达的发酵条件及CIA制备工艺。最佳培养基为（g/L）:蔗糖40,胰蛋白胨20,酵母粉1,K2SO41,MgSO40.25,KH2PO44,Na2HPO4 3,pH6.0;最适摇瓶培养工艺:接种量2%,种龄5h,500mL挡板瓶装液量16%,摇床转速150r/min,37℃培养3.5h。发酵液经胰蛋白酶结合NP40和溶菌酶共同作用快速裂解菌体;裂解液经中空纤维膜超滤,浓缩和纯化目标产物;并利用CTAB结合NaCl的方法去除浓缩液中的核酸,最后经乙醇沉淀得CIA。 先后经CTAB特异吸附分离,弱碱型阴离子交换和凝胶过滤纯化制备了荚膜多糖CPS,利用葡聚糖凝胶层析和琼脂糖凝胶电泳两种方法验证了CPS的相对均一性。通过各种物理和化学分析证明,CPS为连接有肽链的含有大量糖醛酸的多糖复合物,同时可能结合有少量DNA;摩尔质量为109194.3;CPS连接的肽链由17种氨基酸组成,占CPS总质量的2.98%;CPS糖链含有核糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、糖醛酸,且单糖间具有1→6糖苷键连接;糖链与肽链之间以O-糖肽键相连;同时CPS存在呋喃和吡喃两种糖环,并具有α,β两种糖苷构型。 以慢性髓系红白血病K562细胞为模型,研究了CPS诱导肿瘤细胞凋亡的作用。结果表明CPS对K562细胞有明显的抑制作用,可引起细胞形态上明显的凋亡变化,细胞周期分析表明,CPS能引起K562细胞周期的变化,诱导凋亡,并且凋亡程度随CPS浓度的增加,作用时间的延长而增强。 体外免疫活性研究显示CIA能加速B和T淋巴细胞增殖,增强巨噬细胞的吞噬

论文目录:

摘要

Abstract

前言

第一章 文献综述

1.1 免疫系统概述

1.1.1 抗原及抗体

1.1.2 细胞因子

1.1.3 免疫调节

1.1.4 细胞凋亡与免疫调节

1.2 免疫调节剂的研究概况

1.2.1 免疫调节剂的种类

1.2.2 免疫调节剂的作用机理

1.2.3 免疫调节剂的应用前景

1.2.4 细菌表面组分的免疫调节活性

1.2.5 多糖的免疫调节活性

1.2.6 糖蛋白的免疫调节活性

1.3 细菌荚膜

1.3.1 细菌荚膜的结构

1.3.2 荚膜的性质

1.3.3 细菌荚膜多糖的研究现状

1.4 肺炎克雷伯氏菌的研究进展

1.4.1 肺炎克雷伯氏菌的生物学特性

1.4.2 肺炎克雷伯氏菌的表面结构

1.4.3 Kp荚膜糖蛋白的开发

1.4.4 Kp荚膜多糖

1.5 研究意义和目的

参考文献

第二章 肺炎克雷伯氏菌荚膜免疫活性物质的检测方法研究

2.1 实验材料

2.1.1 菌株

2.1.2 实验动物

2.1.3 试剂与仪器

2.2 实验方法

2.2.1 Kp荚膜免疫活性物质抗体的制备

2.2.2 酶联免疫吸附测定用溶液

2.2.3 ELISA操作程序

2.2.4 Kp荚膜免疫活性物质间接ELISA定量法

2.2.5 Kp全菌ELISA定量法

2.3 结果与分析

2.3.1 抗体的制备与纯化

2.3.2 Kp荚膜免疫活性物质ELISA检测方法的建立

2.3.3 Kp全菌ELISA法的建立

2.4 小结

参考文献

第三章 肺炎克雷伯氏菌的体外培养条件优化

3.1 实验材料

3.1.1 菌株

3.1.2 实验动物

3.1.3 培养基

3.2.实验方法

3.2.1 细菌形态学的检测方法

3.2.2 发酵液还原糖的测定

3.2.3 Kp的培养方法

3.3 结果与分析

3.3.1 菌种的体内复壮

3.3.2 种子培养基及培养条件的确定

3.3.3 发酵培养基的优化

3.3.4 摇瓶发酵条件的优化

3.4 小结

参考文献

第四章 Kp荚膜活性物质的提取与纯化

4.1.实验材料

4.2.实验方法

4.2.1 荚膜活性物质检测方法

4.2.2 核酸的检测方法

4.2.3 蛋白质检测方法

4.2.4 脂多糖的定性检测

4.2.5 糖醛酸的分析

4.2.6 CIA提取工艺

4.2.7 CPS纯化

4.3.结果与分析

4.3.1 菌体裂解

4.3.2 裂解液的浓缩

4.3.3 核酸去除

4.3.4 CIA的有机溶剂沉淀

4.3.5 CIA的组成分析

4.3.6 荚膜多糖的分离纯化

4.3.7 荚膜多糖的纯度

4.3.8 荚膜多糖的物质组成

4.4 小结

参考文献

第五章 肺炎克雷伯氏菌荚膜活性物质免疫调节功能的研究

5.1 实验材料

5.1.1 实验样品

5.1.2 实验动物

5.1.3 细胞株

5.1.4 试剂

5.1.5 仪器

5.2 实验方法

5.2.1 对非特异性免疫的影响：碳粒廓清试验

5.2.2 对细胞免疫的影响：ConA体外刺激淋巴细胞增殖试验，MTT法

5.2.3 对体液免疫的影响：溶血空斑试验

5.2.4 对细胞因子TNF生成的影响

5.2.5 CPS的免疫原性研究

5.2.6 统计方法

5.3 结果与分析

5.3.1 对非特异性免疫功能的影响

5.3.2 CPS免疫原性

5.3.3 对细胞免疫功能的影响

5.3.4 对体液免疫功能的影响

5.3.5 对细胞因子TNF-α产生的影响

5.4 小结

参考文献

第六章…Kp荚膜多糖诱导肿瘤细胞K562凋亡的初步研究

6.1材料与方法

6.1.1 试剂

6.1.2 实验仪器

6.1.3 细胞株

6.1.4细胞培养基及溶液

6.2 实验方法

6.2.1 细胞培养、传代、冻存和复苏

6.2.2 细胞毒性试验

6.2.3 形态学观察

6.2.4 CPS对K562细胞凋亡和细胞周期的影响

6.3 结果与分析

6.3.1 CPS的细胞毒性测定(MTT)

6.3.2 形态学观察

6.3.3 琼脂糖凝胶电泳观察—DNA片断化

6.3.4 细胞凋亡和细胞周期的变化

6.4 小结

参考文献

第七章 肺炎克雷伯氏菌荚膜多糖的一级结构表征

7.1 材料与方法

7.1.1 主要试剂

7.1.2 主要仪器与设备

7.2 实验方法

7.2.1 摩尔质量的测定

7.2.2 紫外特征谱图分析

7.2.3 结合核酸分析

7.2.4 单糖组成分析

7.2.5 氨基酸组成分析

7.2.6 糖肽键连接方式分析

7.2.7 糖环构型和糖苷键类型分析

7.2.8 相邻单糖基连接方式的分析

7.3 结果与分析

7.3.1 CPS摩尔质量

7.3.2 紫外光谱分析

7.3.3 单糖组成分析

7.3.4 肽链的氨基酸组成分析

7.3.5 糖肽键连接方式的分析

7.3.6 糖苷键类型和糖环构形分析

7.3.7 相邻单糖基连接方式的分析

7.4 小结

参考文献

第八章 结论与展望

8.1 结论

8.2 创新点

8.3.展望

攻读博士学位期间发表论文情况

致谢

发布时间: 2007-01-10

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