生物活性骨修复材料的构建与生物学响应研究

论文摘要

创伤、肿瘤、感染等因素造成骨组织缺损和破坏困扰和影响人类健康。研制具有调控骨组织相关细胞行为和组织再生过程的生物活性材料成为生物材料领域的热点。本研究从仿生人体骨组织结构与细胞外基质的机制出发,从材料组成、结构优化以及生物因子装载等角度构建新型具有高活性的骨修复材料,并从细胞生物学与体内动物实验等方面较系统地研究材料的组成、结构、生长因子及其之间的协同对细胞行为和组织形成过程的影响规律,并对过程的机理进行了初步的探索。磷酸镁/磷酸钙骨水泥与成骨相关细胞的相互作用研究——镁是骨代谢过程中的重要微量元素。本研究以Ca（H2P04）2和MgO为反应物并掺入磷酸钙骨水泥,控制Mg/P摩尔比例在5、10和20%,分别称为5MCPC.10MCPC和20MCPC.以MG63成骨细胞为模型,体外培养实验结果表明,三种试样均具有良好的生物相容性。外源性的镁以及掺镁骨水泥浸提液的镁对成骨细胞的粘附效率无显著影响。但将细胞直接培养于掺镁骨水泥表面后其粘附效率得到了很大提高。随镁含量的升高掺镁骨水泥的表面粗糙度逐渐减低,细胞骨架却在5MCPC和10MCPC铺展最好。整合素Integrinα5表达在5MCPC和10MCPC表面明显上调,而Integrinα1、α2、β1的表达却没有正影响。溶液中的镁离子在粘附过程是次要的,而材料表面的镁直接参与细胞粘附整合素的信号通路。进一步选用5MCPC研究其对血管内皮细胞增殖与血管发生因子表达的影响发现:内皮细胞在5MCPC表面铺展更好,培养3天后增殖较CPC表面具有显著性差异。5MCPC表面的细胞的血管发生因子表达量有明显上调,其一氧化氮分泌量也有明显提高。这些结果表明较低剂量的镁元素掺入CPC是一种简单而有效的方法以提高成骨细胞粘附及成骨血管发生几率,有利于加速植入材料与新生组织之间生物稳定界面的快速形成以加快骨修复进程。不同含钙量纳米介孔硅基干凝胶对成骨细胞的响应——制备了不同氧化钙含量的介孔硅基干凝胶（0、5、10、15%,命名为m-SXCO、m-SXC5、m-SXC10、m-SXC15）以MG63成骨细胞为模型,体外培养实验结果发现：干凝胶对成骨细胞形态无明显影响。细胞在m-SXC10增殖速率最高。细胞NO表达量随干凝胶中钙含量增高而增高。碱性磷酸酶活性和前列腺素2均在m-SXC5组表达最高。M-SXC5组胶原Ⅰ和骨钙素的基因表达得到了上调。培养7天的n-SXC10细胞外信号调节激酶的磷酸化程度最高。结果表明适量的钙在介孔硅基干凝胶中起到了对成骨细胞活性的重要的调节作用,可作为骨修复领域的更优异的药物控释载体。不同比表面积纳米介孔硅基干凝胶与成骨细胞相互作用研究——比表面积是介孔硅基材料的重要参数,而迄今鲜有关于其对成骨细胞响应的报道。实验制备了3种不同比表面积的干凝胶,结果发现,随表面积的增高蛋白吸附量增加,而表面硅羟基含量却降低。表面磷灰石的生成速率随表面积增高而加快。大比表面积干凝胶有利于成骨细胞增殖。基因表达及流式细胞蛋白检测均表明细胞整合素Integrin a5在大比表面积干凝胶上得到了明显上调。这些结果表明增加干凝胶的比表面积能够通过吸附血清蛋白和加速磷灰石层形成速率从而提高其表面细胞亲和力。调节比表面积也成为一种有效的介孔硅基材料的设计手段,为骨修复和药物控释领域更优异的组织响应能力提供更多的选择。壳聚糖磺酸化修饰及其与骨形态发生蛋白-2的作用机理研究——BMP-2作为有效的生长因子而广泛用于骨修复研究,大剂量使用的潜在副作用限制了其临床的广泛应用。肝素等具有调节BMP-2活性的功能。而磺化壳聚糖类对BMP-2的影响尚未见报道。我们制备了多种不同磺化壳聚糖,以C2C12细胞为模型,实验证明6-O磺化壳聚糖对促进BMP-2活性起到关键作用,而2-N位只起到辅助作用。低浓度的2-N,6-O磺化壳聚糖（26SCS）对BMP-2诱导的碱性磷酸酶活性、矿化形成以及成骨基因表达均有明显促进效果。增加链长和提高磺化度能够进一步提高其活性。26SCS表现出比肝素更好的促进BMP-2能力。体内动物异位成骨实验同样证明了这一现象。这些结果证明26SCS调节BMP-2的信号通路有望作为BMP-2的协同因子。硅酸钙/磷酸钙骨水泥大孔支架与骨形态发生蛋白-2的成骨协同作用研究——将硅酸钙引入到磷酸钙骨水泥体系中制备了复合大孔支架并负载骨形态发生蛋白（BMP-2）,考察二者之间的协同作用。复合支架的蛋白吸附量远高于CPC支架,其体外降解速率也远高于CPC支架。复合支架释放出大量的硅、钙、磷离子。以MG63为细胞模型,间接培养和直接培养实验均表明负载BMP-2的复合支架具有最佳的成骨分化效果。通过micro-CT和组织切片对体内动物实验结果进行分析也得到了同样的结论。本章的结果表明硅酸钙复合磷酸钙大孔骨水泥支架与BMP-2之间存在着明显的协同作用,有望成为优异的骨修复治疗材料。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 骨组织结构
• 1.2 目前常用骨修复材料现状与问题
• 1.3 几种骨修复材料生物功能性调控措施
• 1.3.1 材料化学组成对骨修复功能的调控
• 1.3.2 材料表面结构对骨修复功能的调控
• 1.3.3 骨形态发生蛋白对骨修复功能的调控
• 1.4 本文课题的研究目的、研究意义和研究内容
• 第二章 磷酸镁/磷酸钙骨水泥与成骨相关细胞相互作用研究
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 掺镁磷酸钙骨水泥制备
• 2.2.2 骨水泥X射线衍射分析
• 2.2.3 骨水泥表面形貌SEM观察
• 2.2.4 骨水泥表面接触角测定
• 2.2.5 骨水泥表面粗糙度测定
• 2.2.6 骨水泥灭菌处理
• 2.2.7 离子释放
• 2.2.8 骨水泥试样在培养体系中的pH变化
• 2.2.9 骨水泥蛋白吸附能力测定
• 2.2.10 培养液的配制及消毒
• 2.2.11 成骨细胞培养
• 2.2.12 SEM观察成骨细胞形态
• 2.2.13 骨水泥试样的毒性测定（MTT法）
• 2.2.14 成骨细胞骨架染色和形态学分析
• 2.2.15 成骨细胞粘附测定
• 2.2.16 RT-PCR测定成骨细胞粘附基因
• 2.2.17 人脐带静脉表皮细胞（HUVEC）培养
• 2.2.18 HUVEC的增殖测定
• 2.2.19 HUVEC的细胞形态观察
• 2.2.20 HUVEC的VEGF基因表达测定
• 2.2.21 HUVEC的一氧化氮（NO）测定
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 MCPC表面形貌观察和化学组成分析
• 2.3.2 材料表面XRD晶相组成分析
• 2.3.3 镁含量对骨水泥表面粗糙度的影响
• 2.3.4 镁含量对骨水泥接触角的影响
• 2.3.5 MCPC浸提液的pH变化
• 2.3.6 MCPC试样表面蛋白吸附的影响
• 2.3.7 MCPC对细胞毒性的影响
• 2.3.8 MCPC对细胞形态的影响
• 2.3.9 MCPC对细胞骨架的影响以及细胞形态学测定
• 2.3.10 MCPC对细胞粘附效率的影响
• 2.3.11 镁离子对成骨细胞粘附的影响
• 2.3.12 MCPC对细胞粘附基因Integrin的表达量的影响
• 2.3.13 MCPC对成骨细胞粘附机理的讨论
• 2.3.14 MCPC对HUVEC细胞粘附的影响
• 2.3.15 MCPC对HUVEC细胞增殖的影响
• 2.3.16 MCPC对HUVEC细胞VEGF基因表达的影响
• 2.3.17 MCPC对NO表达量影响
• 2.3.18 MCPC对HUVEC细胞行为影响的讨论
• 2.4 本章小结
• 第三章 不同含钙量纳米介孔硅基干凝胶对成骨细胞的响应
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 介孔硅基干凝胶的制备
• 3.2.2 介孔硅基干凝胶表征
• 3.2.3 细胞培养
• 3.2.4 细胞增殖测定
• 3.2.5 细胞形态观察
• 3.2.6 碱性磷酸酶（ALP）活性测定
• 3.2.7 局部因子产生量测定
• 3.2.8 细胞内钙浓度测定
• 3.2.9 成骨基因表达测定
• 3.2.10 蛋白电泳（Western blot）
• 3.2.11 数据分析
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 含钙纳米介孔干凝胶的表征
• 3.3.2 不同含钙量介孔硅基干凝胶的离子释放
• 3.3.3 不同钙含量的介孔硅基干凝胶对细胞形态的影响
• 3.3.4 不同含钙量的介孔硅基干凝胶对细胞增殖的影响
• 3.3.5 不同含钙量的介孔硅基干凝胶对成骨细胞分化的影响
• 3.3.6 不同含钙量介孔硅基干凝胶对一氧化氮产生量的影响
• 3.3.7 不同含钙量介孔硅基干凝胶对前列腺素2表达量的影响
• 3.3.8 不同含钙量介孔硅基干凝胶对成骨细胞内钙浓度的影响
• 3.3.9 不同含钙量介孔硅基干凝胶对成骨细胞成骨相关基因表达的影响
• 3.3.10 不同含钙量介孔硅基干凝胶对细胞外信号调节激酶活化的影响
• 3.3.11 不同含钙量介孔硅基干凝胶对成骨细胞生物学响应的机理初探
• 3.4 本章小结
• 第四章 不同比表面积纳米介孔硅基干凝胶与成骨细胞相互作用研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 不同比表面积介孔硅基干凝胶的制备
• 4.2.2 介孔硅基干凝胶表面观察
• 4.2.3 X射线衍射分析
• 4.2.4 体外生物活性检测
• 4.2.5 测定干凝胶表面硅羟基含量
• 4.2.6 细胞培养
• 4.2.7 蛋白吸附量测定
• 4.2.8 细胞增殖测定
• 4.2.9 基因表达测定
• 4.2.10 流式细胞仪检测
• 4.2.11 数据统计分析
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 介孔硅基干凝胶的合成以及表征
• 4.3.2 介孔硅基干凝胶的生物活性
• 4.3.3 介孔硅基干凝胶表面硅羟基含量变化
• 4.3.4 比表面积对介孔硅基干凝胶的蛋白吸附能力影响
• 4.3.5 不同比表面积的介孔硅基干凝胶对成骨细胞增殖的影响
• 4.3.6 不同比表面积介孔硅基干凝胶对整合蛋白亚基和成骨基因表达的影响
• 4.3.7 不同比表面积介孔硅基干凝胶对整合蛋白α5的表达影响
• 4.3.8 高比表面积介孔硅基干凝胶促进成骨细胞增殖的机理探讨
• 4.4 本章小结
• 第五章 壳聚糖磺酸化修饰及其与骨形态发生蛋白-2的作用机理研究
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 实验材料与试剂
• 5.2.2 磺化壳聚糖的合成与表征
• 5.2.3 磺化壳聚糖的表征
• 5.2.4 细胞培养
• 5.2.5 碱性磷酸酶（ALP）活性测定
• 5.2.6 细胞增殖测定
• 5.2.7 细胞形态观察
• 5.2.8 基因表达测定
• 5.2.9 免疫荧光测定
• 5.2.10 酶联免疫吸附（ELISA）
• 5.2.11 矿化分析
• 5.2.12 体内动物异位成骨
• 5.2.13 数据统计分析
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 磺化壳聚糖的制备和表征
• 5.3.2 磺化壳聚糖对BMP-2诱导细胞分化的影响
• 5.3.3 磺化多糖对细胞增殖的影响
• 5.3.4 磺化多糖对细胞形态的影响
• 5.3.5 26SCS对BMP-2诱导成骨基因表达的影响
• 5.3.6 26SCS对BMP-2与其细胞表面受体结合的影响
• 5.3.7 26SCS对BMP-2半衰期的影响
• 5.3.8 26SCS对BMP-2诱导细胞矿化的影响
• 5.3.9 26SCS对BMP-2诱导体内异位成骨的影响
• 5.3.10 26SCS与BMP-2作用机理探讨
• 5.4 本章小结
• 第六章 硅酸钙/磷酸钙骨水泥大孔支架与骨形态发生蛋白成骨协同作用研究
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 磷酸钙/硅酸钙大孔支架材料制备
• 6.2.2 X射线衍射分析
• 6.2.3 支架表面形貌观察
• 6.2.4 大孔支架在DMEM培养基中的离子释放、蛋白吸附及pH值变化
• 6.2.5 大孔支架降解测定
• 6.2.6 成骨细胞体外培养
• 6.2.7 细胞形态观察
• 6.2.8 细胞增殖测定
• 6.2.9 细胞分化测定
• 6.2.10 成骨基因表达测定
• 6.2.11 动物体内实验研究
• 6.3 实验结果
• 6.3.1 大孔支架表面形貌观察
• 6.3.2 硅酸钙/磷酸钙骨水泥XRD分析
• 6.3.3 硅酸钙/磷酸钙骨水泥支架表面蛋白吸附能力分析
• 6.3.4 硅酸钙/磷酸钙骨水泥大孔支架的体外降解
• 6.3.5 骨水泥在培养基中的离子释放
• 6.3.6 间接接触培养对成骨细胞性能的影响
• 6.3.7 直接接触材料培养对成骨细胞性能的影响
• 6.3.8 硅酸钙/磷酸钙骨水泥与骨形态发生蛋白复合支架植入动物体内分析
• 6.3.9 机理讨论
• 6.4 本章小结
• 第七章 总结及展望
• 7.1 全文总结
• 7.2 创新点
• 7.3 延伸课题
• 在澳大利亚合作科研内容简介
• 参考文献
• 致谢
• 发表的文章
• 参与的科研项目