低糖链茶皂甙的制备及抗氧化活性评价

论文摘要

茶皂甙又称茶皂素,是一类结构相近的齐墩果烷型五环三萜类皂甙的混合物。现已发现具有抗菌、抗病毒、消炎、抗氧化等多种生理活性,广泛用于日用化工、农药及食品工业,有良好的应用前景。本论文以提高茶皂甙的抗氧化活性为目的,采用生物转化的方法改变茶皂甙的结构以获得高活性的茶皂甙。研究中采用AB-8大孔树脂纯化茶皂甙,利用生物转化的最优条件制备低糖链茶皂甙,采用薄层层析（TLC）对酶解前后的皂甙进行分析,通过硅胶柱分离新产生的茶皂甙,用DPPH法对酶解前后的茶皂甙的抗氧化能力进行检测,并通过超高压液相色谱-质谱联用技术对酶解前后的皂甙进行分析。实验利用AB-8大孔吸附树脂纯化油茶皂甙,在最佳反应条件下酶解茶皂甙,最佳反应条件为反应温度50℃,底物浓度5mg/mL,pH=6.0,反应时间16h。在薄层层析（TLC）检测茶皂甙过程中,考察了展开剂的配比对新产生的茶皂甙分离效果的情况,使得分离效果达到最佳。对酶解后茶皂甙进行TLC分析,得到迁移率分别为0.79、0.63、0.49、0.25四种新皂甙。利用硅胶柱分离酶解后的茶皂甙,考察了洗脱剂配比对分离效果的影响,确定了最佳洗脱条件：洗脱剂的配比为氯仿：甲醇=9.8：0.2,9.5：0.5,8：2,7：3。DPPH法检测酶解前后茶皂甙的抗氧化活性变化情况,用Vc、Ve做参比,考察了实验过程中最佳的反应时间和最适浓度。将300min作为测定茶皂甙清除率的最终反应时间；选择0.156mg/mL为对比浓度。结果表明：酶解后的茶皂甙,抗氧化活性均有大幅度提高,都比未酶解时高,但程度各异,尤其是Rf=0.49的新产物,清除率超过了95%。并且该产物与DPPH的反应十分迅速,反应时间要远远少于未酶解的皂甙,而且清除率接近Vc,可见其抗氧化活性提高幅度之大。采用LC-MS对茶皂甙和酶解后新皂甙进行分析,发现茶皂甙经过生物转化后,结构产生了变化,有新产物生成。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 1.1 茶皂甙的性质、结构与生物活性
• 1.1.1 茶皂甙的性质
• 1.1.2 茶皂甙的结构
• 1.1.3 茶皂甙的生物活性
• 1.2 茶皂甙的分析方法
• 1.2.1 茶皂甙的含量测定方法
• 1.2.1.1 化学分析
• 1.2.1.2 光谱分析
• 1.2.1.3 色谱法分析
• 1.2.2 茶皂甙结构的测定分析
• 1.3 茶皂甙的提取和纯化方法
• 1.3.1 茶皂甙的提取方法
• 1.3.1.1 水提法
• 1.3.1.2 有机溶剂提取法
• 1.3.1.3 超临界流体萃取法
• 1.3.1.4 超声波法
• 1.3.1.5 微波萃取法
• 1.3.2 茶皂甙的纯化方法
• 1.3.2.1 重结晶法
• 1.3.2.2 吸附法
• 1.3.2.3 正丁醇萃取法
• 1.3.2.4 鼓泡与泡沫分离法
• 1.3.2.5 硅胶柱层析
• 1.3.2.6 离子交换树脂法
• 1.3.2.7 絮凝剂法
• 1.3.2.8 超滤膜法
• 1.3.2.9 大孔树脂法
• 1.4 茶皂甙糖链的功能
• 1.4.1 皂甙中糖链与其生物活性的关系
• 1.4.2 改变皂甙糖基提高其活性的研究进展
• 1.5 抗氧化活性评价的意义
• 1.5.1 生物的衰老机理
• 1.5.2 氧自由基的产生及其致病机理
• 1.5.3 天然产物的抗氧化机理及应用
• 1.5.4 抗氧化剂的分类
• 1.5.4.1 维生素类抗氧化剂
• 1.5.4.2 植物来源抗氧化剂
• 1.5.4.3 多肽、氨基酸类抗氧化剂
• 1.5.5 抗氧化的检测方法
• 1.6 本课题的立题意义和研究内容
• 第二章 实验方法
• 2.1 主要材料与设备
• 2.1.1 实验原料
• 2.1.2 实验菌种
• 2.1.3 实验药品
• 2.1.4 主要设备
• 2.2 油茶皂甙的纯化
• 2.2.1 AB-8大孔树脂柱的预处理
• 2.2.2 油茶皂甙的纯化
• 2.3 菌种的斜面培养
• 2.3.1 培养基的制备
• 2.3.2 接菌
• 2.3.3 菌种的培养
• 2.3.4 菌种的扩培
• 2.4 粗酶液的提取及茶皂甙的酶解
• 2.4.1 黑曲霉β-葡萄糖苷酶
• 2.4.2 粗酶液的提取
• 2.4.3 茶皂甙的酶解
• 2.4.4 展开剂的优化与TLC分析
• 2.5 分离茶皂甙的酶解新产物
• 2.5.1 洗脱剂分离茶皂甙的条件优化
• 2.5.2 硅胶柱分离茶皂甙实验
• 2.6 酶解后茶皂甙的抗氧化活性
• 2.6.1 DPPH法检测
• 2.6.2 DPPH检测酶解前茶皂甙的抗氧化活性
• 2.6.3 DPPH检测酶解后茶皂甙的抗氧化活性
• 2.6.4 数据统计分析
• 2.7 LC-MS分析酶解前后茶皂甙的变化
• 2.7.1 LC-MS方法
• 2.7.2 LC-MS的分析条件
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 AB-8大孔树脂纯化油茶皂甙
• 3.1.1 粗茶皂甙的预处理
• 3.1.2 AB-8大孔树脂纯化茶皂甙的结果
• 3.2 酶解产物及分离
• 3.2.1 酶解后的茶皂甙
• 3.2.2 TLC条件的优化
• 3.2.3 TLC检测结果
• 3.2.4 新产物的分离
• 3.3 抗氧化活性的检测
• 3.3.1 最佳反应时间、浓度的确定
• 3.3.2 酶解前后茶皂甙对DPPH清除率的对比
• 3.3.3 Rf=0.49的新产物的抗氧化活性
• 3.3.4 新产物的抗氧化活性与Vc、Ve的对比
• 3.4 茶皂甙及其酶解产物的LC-MS
• 3.4.1 未酶解茶皂甙的LC-MS分析
• 3.4.2 酶解后茶皂甙的LC-MS分析
• 3.4.2.1 茶皂甙酶解产物的LC-MS分析
• 3.4.2.2 Rf=0.79的茶皂甙酶解产物的LC-MS分析
• 3.4.2.3 Rf=0.63的茶皂甙酶解产物的LC-MS分析
• 3.4.2.4 Rf=0.49的茶皂甙酶解产物的LC-MS分析
• 3.4.2.5 Rf=0.25的茶皂甙酶解产物的LC-MS分析
• 第四章 结论
• 参考文献
• 致谢