SARS冠状病毒S蛋白抗原表位分析与定位研究

论文题目: SARS冠状病毒S蛋白抗原表位分析与定位研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 预防兽医学

作者: 华荣虹

导师: 童光志

关键词: 冠状病毒,纤突蛋白,单克隆抗体,表位,表位作图

文献来源: 中国农业科学院

发表年度: 2005

论文摘要: 严重急性呼吸综合症（Severe acute respiratory syndrome, SARS）是由SARS冠状病毒（SARS-CoV）引起的人类新发传染病,S、M、N、E蛋白是SARS-CoV病毒粒子的几种主要结构蛋白。用Lasergene软件系统分析SARS病毒结构蛋白S、M、N蛋白,预测了12个抗原表位,用这些预测表位序列设计组合成四个嵌合基因SSCV-A、SSCV-B、SSCV-C、SSCV-D。人工合成后插入pGEX-6p-1的BamHI和XhoI位点间,构建成融合表达质粒,转化宿主菌BL21经IPTG诱导后嵌合基因表达产物为可溶性蛋白。经免疫印迹试验表明嵌合基因表达产物可被SARS康复患者血清所识别,表明重组融合蛋白具有免疫反应性,提示预测表位中含有SARS-CoV结构蛋白的抗原表位。用纯化的重组融合蛋白GST-SSCV-D和GST-SSCV-A为抗原制备了一系列单克隆抗体。抗SSCV-D的单抗有两株,分别为D3D1和D3C5。将6个S蛋白预测表位分别与GST融合表达。在这6个融合蛋白中,GST-S5可以和单克隆抗体D3C5反应,GST-S2可以和单抗D3D1反应。Western blot分析表明两个单抗所识别的表位均为线性表位。两个表位分别位于SARS-CoV纤突蛋白的第447至458氨基酸残基和789至799氨基酸残基。D3D1表位（447～458）正位于S蛋白与受体结合的结构域中。 2C5是一株SARS-CoV S蛋白特异的有中和活性的单克隆抗体。以2C5为筛选靶分子,筛选噬菌体展示随机7肽库。经三轮淘洗后随机挑选20个噬菌体克隆进行ELISA分析和序列测定。在10个ELISA OD值大于0.2的阳性噬菌体克隆中,有8个噬菌体克隆展示有共同的7肽序列TPEQQFT。展示有该序列的噬菌体克隆能竞争抑制SARS-CoV S蛋白抗原与单抗2C5的结合。与SARS-CoV S蛋白序列比对分析发现该7肽序列散布于S蛋白的第539位到第559位氨基酸上。将S蛋白T539PSSKRFQPFQQFGRDVSDFT559的21肽与GST进行融合表达,得到了可溶解的融合蛋白。该融合蛋白能不能被单抗2C5识别,但经Western blot分析表明该融合蛋白能被灭活SARS冠状病毒免疫鸡血清识别。表明T539PSSKRFQPFQQFGRDVSDFT559是S蛋白的一个线性表位,而TPEQQFT为单克隆抗体2C5的模拟表位。 SARS冠状病毒S蛋白在病毒与宿主细胞受体结合、细胞膜融合及入侵、诱导机体产生中和抗体中起重要作用。S蛋白受体结合结构域的核心区域为318～510片段。克隆并融合表达了S蛋白318～510片段,分析表明原核表达的受体结合结构域融合蛋白能被SARS康复患者清和高免动物血清所识别。进一步设计了一套23个覆盖整个该受体结合结构域的长为16氨基酸残基的部分重叠的短肽,并进行了融合表达。用23个融合蛋白对受体结合结构域进行抗原表位作图。结果鉴定出两个抗原表位SRBD3(F334PSVYAWERKKISNCV349)和表位D3D1(K447LRPFERDI455)。 SARS冠状病毒S蛋白S1部分在与细胞受体结合以及诱导机体产生保护性中和抗体中发挥重要作用。用PCR扩增S1（12～672）及S1N（12～510）,S1C（318～672）和SRBD（318～510）四个片段。PCR产物分别克隆到表达载体pGEX-6p-1中,经诱导各融合蛋白均以包涵体形式表达。Western

论文目录:

引言

1 SARS-CoV的形态结构

2 SARS-CoV的病原学与分类

3 SARS-CoV的基因组研究进展

4 SARS-CoV的受体

5 SARS-CoV的包装信号

6 SARS-CoV基因组编码蛋白

7 SARS-CoV S蛋白抗原表位的研究进展

8 SARS-CoV N蛋白抗原表位的研究进展

9 SARS的免疫学及分子生物学诊断方法研究进展

10 SARS防治研究进展

11 存在的问题与展望

12 本研究目的与意义

研究报告

实验一 SARS冠状病毒结构蛋白表位预测及多表位嵌合基因的构建与表达

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

1.2 酶与标记物

1.3 抗SARS-CoV血清

1.4 结构蛋白抗原表位的预测

1.5 嵌合基因的设计与合成

1.6 pGEX-SSCV融合表达载体的构建

1.7 重组质粒的原核表达与纯化

1.8 Western biot检测融合蛋白与SARS康复病人血清的免疫反应性

2 结果

2.1 结构蛋白特性分析及表位预测

2.2 嵌合基因的设计

2.3 融合表达质粒的构建

2.4 GST-SSCV融合蛋白的表达

2.5 GST-SSCV融合蛋白的纯化

2.6 融合蛋白的免疫反应性

3 讨论

实验二 SARS冠状病毒单克隆抗体的制备及表位鉴定

1 材料与方法

1.1 单克隆抗体的制备

1.2 表达S蛋白预测表位寡核苷酸链的设计

1.3 表达覆盖S2和S5的9氨基酸短肽系列的设计

1.4 预测表位及9肽的融合表达

1.5 酶联免疫吸附试验(ELISA)

1.6 免疫印迹试验(Western blot)

2 结果

2.1 预测表位及9肽融合蛋白的表达

2.2 重组多表位融合蛋白GST—D免疫印迹检测结果

2.3 预测表位融合蛋白GST—S2和GST—S5免疫印迹检测结果

2.4 单克隆抗体的制备与鉴定

2.5 单克隆抗体的表位鉴定

2.6 单克隆抗体表位的精确定位

3 讨论

实验三 SARS冠状病毒S蛋白单克隆抗体2C5识别表位的鉴定

1 材料与方法

1.1 噬菌体随机肽库、菌株和单克隆抗体

1.2 其它试剂与材料

1.3 主要试剂的配制

1.4 噬菌体的滴定

1.5 噬菌体肽库的亲和筛选

1.6 筛选噬菌体的克隆和扩增

1.7 噬菌体序列的测定

1.8 噬菌体ELISA

1.9 噬菌体竟争抑制ELISA

1.10 多肽的融合表达与融合蛋白的纯化

1.11 融合蛋白与单克隆抗体2C5的ELISA分析

1.12 融合蛋白与鸡抗SARS冠状病毒血清的Western blot分析

2 结果

2.1 噬菌体肽库的筛选

2.2 噬菌体的克隆与结合分析

2.3 噬菌体展示序列的测定与分析

2.4 噬菌体的竟争ELISA

2.5 短肽的融合表达与纯化

2.6 融合蛋白的免疫反应性

3 讨论

实验四 SARS冠状病毒S蛋白S1部分的表达与免疫分析

1 材料与方法

1.1 质粒、菌种及SARS基因

1.2 血清、抗体及试剂

1.3 S1、S1N、S1C及SRBD基因片段的PCR扩增

1.4 S1、S1N、S1C及SRBD片段表达质粒的构建

1.5 重组质粒的诱导表达

1.6 表达产物的Western blot分析

1.7 表达产物的ELISA分析

2 结果

2.1 PCR扩增

2.2 重组质粒的构建与鉴定

2.3 重组质粒的诱导表达

2.4 表达产物的Western blot分析

2.5 表达产物的ELISA分析

3 讨论

实验五 SARS冠状病毒S1蛋白主要抗原决定区的表位作图

1 材料与方法

1.1 质粒怀菌株

1.2 酶与标记物

1.3 抗SARS-CoV阳性血清及真核表达S蛋门抗原

1.4 短肽融合蛋白的设计

1.5 短肽融合蛋白表达质粒的构建及表达纯化

1.6 鼠抗融合蛋白血清的制备

1.7 Western blot

1.8 ELISA

1.9 动物免疫

1.10 间接免疫荧光试验

2 结果

2.1 短肽融合蛋白的表达与纯化

2.2 抗原表位作图

2.3 抗原表位的免疫原性

2.4 抗表位单因子血清的特性

3 讨论

实验六 SARS冠状病毒S蛋白受体结合结构域的表达及表位作图

1 材料和方法

1.1 质粒与菌株

1.2 酶与标记物

1.3 抗SARS-CoV阳性血清

1.4 pGEX-SRBD融合表达载体的构建与表达

1.5 短肽融合蛋白的设计与表达纯化

1.6 短肽融合蛋白表达质粒的构建及表达纯化

1.7 鼠抗融合蛋白GST-SRBD和GST-SRBD3血清的制备

1.8 Western blot

1.9 ELISA

2 结果

2.1 受体结合结构域的融合表达与免疫印迹分析

2.2 短肽融合蛋白的表达与纯化

2.3 短肽融合蛋白的Western blot分析与ELSIA分析

2.4 SRBD3的免疫原性

2.5 受体结构区抗原表位作图结果

3 讨论

结论

参考文献

致谢

作者简介

发布时间: 2005-09-05

参考文献

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