Atp6v1c1在破骨细胞中功能及在肿瘤细胞生长、迁移中作用的研究

论文摘要

V-ATPase广泛存在于真核细胞,调控细胞内外环境pH的变化而发挥功能。存在于激活的破骨细胞皱褶缘（Ruffled border,RB）的V-ATPase质子泵的细胞外酸化功能是骨吸收所必需的。然而特异的破骨细胞皱褶缘V-ATPase的组成和结构仍然没有被阐明清楚。本研究发现V-ATPase的C亚基Atp6v1c1（C1）亚型在破骨细胞中高表达,而C亚基的另外两个亚型Atp6v1c2a（C2a）和Atp6v1c2b（C2b）在破骨细胞中几乎不表达;在破骨细胞体外诱导分化过程中RANKL诱导Atp6v1c1高表达;Atp6v1c1与Atp6voa3（a3）相互作用;在体内激活的破骨细胞中Atp6v1c1主要定位在皱褶缘;体外培养的成熟破骨细胞中Atp6v1c1和微管共定位在细胞浆。本研究首次采用慢病毒介导RNA干扰技术在破骨细胞中表达Atp6v1c1特异siRNA,发现Atp6v1c1表达被敲低后严重影响了破骨细胞的细胞外酸化和骨吸收功能而骨髓单核细胞分化成多核破骨细胞并不受影响,与Atp6v0a3表达敲低的破骨细胞表现相似。主要包含微丝的环（F-actin ring）的形成由于C1表达被敲低而被严重破坏,而a3表达敲低或a3敲除并不影响破骨细胞F-actin环的形成;C1与F-actin在抗酒石酸酸性磷酸酶阳性（TRAP+）的单核细胞中共定位在细胞浆,且随着单核细胞分化为成熟的多核破骨细胞C1与F-actin共同定位大部分从细胞浆迁移到了细胞外周并行成环状带。本研究结果表明Atp6v1c1是破骨细胞皱褶缘质子泵的主要成分,且参与调控破骨细胞激活过程中F-actin环的形成。本研究采用逆转录病毒介导C1在破骨细胞中过表达,发现C1过表达不能抑制Src激酶的抑制剂PP2对破骨细胞F-actin环的破坏作用,结果表明C1调控破骨细胞F-actin环的形成过程中需要其它因子的协同作用。在肿瘤细胞中胞浆膜V-ATPase在肿瘤细胞的生长、迁移、凋亡和癌细胞的抗药性中发挥重要功能。虽然C1亚基在人口腔鳞状细胞癌中明显较正常组织高表达,但C1高表达在肿瘤细胞的生长和迁移中的作用仍未阐明。本研究发现V-ATPase的一个亚基Atp6v1c1在肿瘤细胞中广泛表达,且C1敲低后小鼠乳腺癌细胞系4T1和大鼠骨肉瘤细胞系UMR-106的生长明显延缓,且二者的迁移能力明显下降。结果表明ATP6v1c1可能参与调控肿瘤细胞的生长和迁移。

论文目录

• 致谢
• 序言
• 中文摘要
• 英文摘要
• 目次
• 1.文献综述
• 1.1 破骨细胞和V-ATPase的结构和功能调控
• 1.1.1 破骨细胞和骨吸收
• 1.1.2 V-ATPase的组成和结构
• 1.1.3 V-ATPase及各组成亚基的功能
• 1.1.4 V-ATPase功能的调控
• 1.2 破骨细胞激活过程中V-ATPase和丝状肌动蛋白间的相互作用
• 1.2.1 丝状肌动蛋白在破骨细胞中的存在形式和功能
• 1.2.2 破骨细胞中V-ATPase和丝状肌动蛋白间的关系
• 1.2.3 F-actin在V-ATPase稳定和解离中的作用
• 1.3 V-ATPase在肿瘤细胞中生长和转移中的作用
• 1.4 参考文献
• 2.实验研究
• 2.1 Atp6v1c1（C1）在小鼠破骨细胞中表达及Atp6v1c1在RANKL和M-CSF体外诱导骨髓单个核细胞分化成熟为破骨细胞过程中表达变化的研究
• 2.1.1 材料与方法
• 2.1.2 实验结果
• 2.1.2.1 Atp6v1c1在破骨细胞中的表达
• 2.1.2.2 V-ATPase质子泵各亚基在破骨细胞中的表达
• 2.1.2.3 Atp6v1c1在骨髓单核细胞向破骨细胞分化过程中的表达变化
• 2.1.3 本节讨论
• 2.2 在原代培养的破骨细胞中逆转录病毒介导Atp6v1c1特异SiRNA表达对破骨细胞分化、成熟、细胞外酸化和骨吸收功能的影响及Atp6v1c1在破骨细胞中的定位和与Atp6i的关系
• 2.2.1 材料与方法
• 2.2.2 实验结果
• 2.2.2.1 Atp6v1c1-Flag在外源有效的表达
• 2.2.2.2 有效RNA干扰靶序列的筛选
• 2.2.2.3 慢病毒产生致包装细胞产生明显病变效应
• 2.2.2.4 病毒滴度的测定
• 2.2.2.5 表达特异Atp6v1c1 siRNA的病毒感染破骨细胞后能有效敲低Atp6v1c1蛋白的表达
• 2.2.2.6 敲低破骨细胞Atp6v1c1和Atp6v0a3的表达不影响破骨细胞分化和成熟
• 2.2.2.7 Atp6v1c1敲低后不影响破骨细胞的凋亡
• 2.2.2.8 Atp6v1c1敲低的破骨细胞酸化功能被破坏,其骨吸收能力下降
• 2.2.2.9 Atp6v1c1定位于体内激活的破骨细胞中,同时在破骨细胞中与a3相互作用,并在体外培养的成熟破骨细胞中与细胞微管共定位于细胞浆
• 2.2.3 本节讨论
• 2.3 Atp6v1c1在破骨细胞激活过程中包含F-actin特殊结构sealing ring的形成中的作用
• 2.3.1 材料与方法
• 2.3.2 实验结果
• 2.3.2.1 Atp6v1c1敲低抑制F-actin环的形成
• 2.3.2.2 Atp6v1c1与F-actin在破骨细胞中共定位
• 2.3.2.3 ATP6v1c1过表达不能抑制PP2对破骨细胞F-actin环的破坏作用
• 2.3.3 本节讨论
• 2.4 Atpv1c1在肿瘤细胞生长和迁移中作用的初步研究
• 2.4.1 材料与方法
• 2.4.2 实验结果
• 2.4.2.1 ATP6v1c1在肿瘤细胞中的表达
• 2.4.2.2 Atp6v1c1敲低后肿瘤细胞生长速度延缓
• 2.4.2.3 Atp6v1c1敲低后肿瘤细胞的迁移能力明显下降
• 2.4.3 本节讨论
• 2.5 本章总结
• 参考文献
• 附录（试剂配制）
• 缩略语索引
• 作者简历