瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ蛋白质工程改造和表达研究

论文摘要

纤维素酶已经被成功应用于纺织、造纸、食品、饲料工业,并且随着生物能源工业的出现,其市场潜力越来越大。当纤维素酶被用于纺织、造纸等纤维加工工业中时,往往需要接触一些偏碱性的环境。而大多真菌纤维素酶由于在高pH下活力丧失严重,其应用受到诸多限制。许多研究者希望通过蛋白质工程的手段改造纤维素酶并获得其最适pH和酶活力均有所上升的突变体酶。酿酒酵母由于其转化和表达的高效性是一种良好的分子改造的宿主。许多来源于真菌的纤维素酶已经被表达于酿酒酵母中,并获得了具有活性的重组酶蛋白。内切葡聚糖酶Ⅱ（EGⅡ）是瑞氏木霉中最主要的内切酶之一,删除EGⅡ的瑞氏木霉其内切酶活性丧失了55%以上。在本实验室前期的工作中,从使用酿酒酵母H158构建的瑞氏木霉cDNA文库中获得了内切葡聚糖酶Ⅱ的基因eg2,并利用的定向进化方法筛选到一个最适pH有所提高的突变体。通过进一步研究酿酒酵母中表达的重组内切葡聚糖酶Ⅱ（rEGⅡ）的酶学性质和使用定向进化的手段提高其功能,可以进一步阐明酶的结构和其最适pH的关系。这不仅可使瑞氏木霉内切葡聚糖酶更好的应用于偏碱性环境,也为研究蛋白质的结构与功能的关系提供了有用的数据和信息。本文的研究成果主要如下:1.分析了糖基化对rEGⅡ的影响首先建立了表达于酿酒酵母H158的rEGⅡ的分离纯化的方法,并进行了SDS-PAGE后的活性染色:发现重组EGⅡ具有能吸附于阳离子琼脂糖凝胶的C1和不能吸附的C2两部分。C1部分是一个分子量57KDa的蛋白,经内切糖苷酶H（Endo H）酶解去除N糖基化后,其分子量下降为54 KDa,并保持大约88%的酶活力。C2部分是一个大分子量蛋白的集合体,经Endo H酶解后,其分子量同样下降为54 KDa。重组C1和C2部分对底物的降解能力和来源于瑞氏木霉本身的native-EGⅡ相似;C2部分具有对更高pH的适应性和更好的耐温性。2.分析了rEGⅡ第124位去N-糖基化后对重组酶性质的影响使用重叠延伸的方法对rEGⅡ的N-糖基化位点N124进行了定点突变,获得了N124D和N124H的突变体。重组N124D和N124H的突变体酶同样具有C1和C2两部分,其C1部分的分子量为54KDa,和经Endo H处理过的野生型的C1部分相同,显示去除N糖基化为其分子量的降低的原因。使用粗酶液测定了它们的胞外CMCase活性、最适pH和对温度的适应性,未发现去除N-糖基化的突变蛋白和野生型蛋白在以上酶学性质上有明显区别。3.对rEGⅡ的第342位位点进行了饱和突变和突变酶性质分析,探讨了此位点在影响rEGⅡ酶学性质上的作用实现了对于来源于瑞氏木霉的内切葡聚糖酶Ⅱ的第342位位点的饱和突变,分析了此位点的突变对酶蛋白最适pH和酶活性的影响。将突变氨基酸分成3类,发现带有脂肪侧链的氨基酸的突变,如突变体N342V,N342I,N342L均可以使酶蛋白的最适pH向中性发生偏移。最大的偏移发生在N342R的突变体上,带来了最适pH大约1.2的偏移,但其酶活力较野生型有大幅度下降。同属于碱性氨基酸突变的N342K并未带来最适pH的改变。同源建模显示,N342位于EGⅡ外层α螺旋的C端。推测侧链的增大和H键的增多使螺旋更加的稳定,从而影响了酶在高pH下的活力。4.使用易错PCR和DNA重排的方法实现了对rEGⅡ的定向进化,获得了几个酶学性质有一定改良的突变体使用定向进化（包括随机突变和DNA重排）的手段实现了对rEGⅡ的改造。纯化的突变体酶中,N39R/L218H/W276R/N342T的最适pH可以达到6.0～6.2,在pH 6.2时催化效率较野生型提高了1.4倍。L218H和Q139R/N342T尽管其最适pH变化不大,但其在pH 7.0时的催化效率较野生型提高了4倍。突变体结构和功能的分析表明,更多稳定的螺旋和催化残基以及底物之间静电作用的改变是突变体酶性质较野生型酶发生改变的原因。5.对糖苷水解酶家族5中纤维素内切酶信息学研究对糖苷水解酶家族5中纤维素内切酶的氨基酸序列以及最适pH的数据进行了收集,初步探究了氨基酸组成对纤维素内切酶最适pH的影响。研究了纤维素内切酶中H+R、C+Y含量与最适pH的关系:发现随着H+R含量的上升,纤维素内切酶的最适pH有所上升;随着C+Y含量的上升,纤维素内切酶的最适pH有所下降。收集到7个已知最适pH和已知晶体结构的纤维素内切酶,并和瑞氏木霉EGⅡ的性质进行了比对,它们的三级结构非常相似,酶解机制相同但具有完全不同的最适pH。6.建立了高效的黑曲霉原生质体制备和再生的方法为进一步提高重组酶蛋白的表达量,探索了建立黑曲霉转化表达系统的方法。结果表明,培养14h的幼嫩菌丝体最适于制备原生质体,选用0.6MKCl为最适渗透压稳定剂,3g/L蜗牛酶-4.5g/L纤维素酶-1.5g/L溶壁酶为裂解酶组合,32℃,酶解2h,原生质体的形成量可达到106～107。采用双层平板法培养,原生质体再生率可达45%。使用改良转化液,自主复制型质粒ANEp7转化黑曲霉N593的转化率为大约30个/μg质粒。7.瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ在黑曲霉中的表达构建了带有自主复制序列AMA1的自主复制表达载体ANEp7。将含有瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ基因的自主复制型载体转化进入黑曲霉,并对其是否表达重组EGⅡ和自主复制型载体的丢失情况进行了检测。研究显示,此种自主复制表达载体的丢失率非常高,当传代至第三代时丢失率可达100%。成功构建了整合型表达载体ANIp7-eg2,但尚未能得到整合型表达载体的转化子。提高原生质体的质量和改良转化条件以得到整合型表达载体的转化子,是下步工作的目标。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明及缩略词
• 第一节 综述
• 1.1 纤维素酶
• 1.1.1 糖苷水解酶家族和纤维素酶命名法
• 1.1.2 纤维素酶系的组成
• 1.1.3 纤维素酶的酶学性质
• 1.2 纤维素酶异源表达的研究进展
• 1.2.1 在酵母中表达的纤维素酶
• 1.2.2 在细菌中表达的纤维素酶
• 1.2.3 丝状真菌中表达的纤维素酶
• 1.3 纤维素酶蛋白质工程的研究进展
• 1.3.1 蛋白质工程的研究手段和方法
• 1.3.2 蛋白质工程在纤维素酶蛋白改造上的应用
• 1.4 本研究的目的与主要工作内容
• 第二节 重组瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ的糖基化分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基和培养方法
• 2.1.3 试剂,工具酶与仪器
• 2.1.4 来源于酿酒酵母H158的rEGⅡ的分离纯化
• 2.1.5 来源于瑞氏木霉QM9414的native-EGⅡ的分离纯化
• 2.1.6 蛋白质电泳和活性染色
• 2.1.7 重组EGⅡ分子量的确定
• 2.1.8 重组EGⅡ的去糖基化
• 2.1.9 内切葡聚糖酶活性测定
• 2.1.10 pH对酶活力的影响
• 2.1.11 酶耐温性
• 2.1.12 重组EGⅡ和native-EGⅡ对不同纤维素多聚物的降解能力的测定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 SC培养基中表达有rEGⅡ的酿酒酵母的生长及rEGⅡ的合成情况
• 2.2.2 来源于瑞氏木霉的野生型内切葡聚糖酶Ⅱ（native-EGⅡ）的纯化
• 2.2.3 来源于酿酒酵母的重组内切葡聚糖酶Ⅱ（rEGⅡ）的分离纯化
• 2.2.4 rEGⅡ蛋白的异质性和其去糖基化后的性质分析
• 2.2.5 重组EGⅡ和native-EGⅡ对不同纤维素多聚物的降解能力
• 2.2.6 pH对重组EGⅡ和native EGⅡ酶活力的影响
• 2.2.7 温度对重组EGⅡ和native EGⅡ酶活力的影响
• 2.2.8 培养基成分对重组EGⅡ糖基化程度和酶活力的影响
• 2.3 讨论
• 2.3.1 糖基化对重组EGⅡ性质的影响
• 2.3.2 糖基化对其它重组蛋白性质的影响
• 2.3.3 展望
• 小结
• 第三节 重组瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ第124位N糖基化位点的敲除及突变体酶性质分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 菌株和质粒
• 3.1.2 培养基和培养方法
• 3.1.3 试剂,工具酶和仪器
• 3.1.4 大肠杆菌转化,质粒的提取及分子克隆操作
• 3.1.5 序列测定与分析
• 3.1.6 定点突变
• 3.1.7 酿酒酵母的转化
• 3.1.8 酵母质粒的提取
• 3.1.9 蛋白质电泳和活性染色
• 3.1.10 pH和温度对酶活力的影响
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 敲除N124糖基化位点（N124H,N124D）的突变氨基酸的选择
• 3.2.2 突变引物的设计
• 3.2.3 敲除N124糖基化位点（N124H,N124D）的定点突变
• 3.2.4 重组表达载体pAJ401-eg2-N124H和pAJ401-eg2-N124D的构建
• 3.2.5 敲除N124糖基化位点后的突变酶（N124H,N124D）的酶学性质
• 3.3 讨论
• 3.3.1 重组EGⅡ第124位去N-糖基化后对突变重组酶性质的影响
• 3.3.2 SDS-PAGE后活性染色在分离纯化中的作用
• 3.3.3 展望
• 小结
• 第四节 重组内切葡聚糖酶Ⅱ第342位位点的饱和突变和此位点对酶最适pH和活性的影响
• 4.1 材料和方法
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 培养基和培养方法
• 4.1.3 试剂,工具酶与仪器
• 4.1.4 对342位位点的饱和突变
• 4.1.5 大肠杆菌转化、质粒的提取及分子克隆操作
• 4.1.6 序列测定与分析
• 4.1.7 酿酒酵母的转化
• 4.1.8 酵母质粒的提取
• 4.1.9 突变体酶的活力测定
• 4.1.10 突变体酶最适pH的测定
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 饱和突变引物的设计
• 4.2.2 重叠延伸法对342位位点的饱和突变
• 4.2.3 N342A、N342E、N342M、N342W的定点突变
• 4.2.4 各突变体酶的最适pH及其酶活力的比较
• 4.2.5 酶蛋白的同源建模和结构分析
• 4.3 讨论
• 4.3.1 342位位点影响酶蛋白性质的作用机理分析
• 4.3.2 饱和突变在定向进化中的应用
• 4.3.3 展望
• 小结
• 第五节 重组内切葡聚糖酶Ⅱ的定向进化
• 5.1 材料和方法
• 5.1.1 菌株和质粒
• 5.1.2 培养基和培养方法
• 5.1.3 试剂,工具酶与仪器
• 5.1.4 大肠杆菌转化、质粒的提取及分子克隆操作
• 5.1.5 序列测定与分析
• 5.1.6 酿酒酵母的转化和酵母质粒的提取
• 5.1.7 突变菌株的筛选
• 5.1.8 来源于酿酒酵母H158的突变体酶的分离纯化
• 5.1.9 突变体酶的活力测定
• 5.1.10 突变体酶最适pH的测定
• 5.1.11 Km值的测定
• 5.1.12 圆二色性谱测定
• 5.2 结果与分析
• 5.2.1 表达于酿酒酵母的定向进化流程
• 5.2.2 使用GeneMorph Random Mutagenesis Kit进行的易错PCR
• 5.2.3 常规易错PCR
• 5.2.4 对突变体进行DNA重排
• 5.2.5 突变频率的测定和突变体酶的筛选
• 5.2.6 突变体酶的酶学性质
• 5.3 讨论
• 5.3.1 各突变点在酶蛋白上的位置及其影响酶学性质的机理分析
• 5.3.2 定向进化技术在提高酶的最适pH和酶活性中的应用
• 5.3.3 展望
• 小结
• 第六节 糖苷水解酶家族5中纤维素内切酶信息学研究
• 6.1 材料和方法
• 6.1.1 氨基酸序列的收集与氨基酸含量的计算
• 6.1.2 纤维素内切酶最适pH的收集
• 6.1.3 氨基酸含量与最适pH的回归方程的计算
• 6.1.4 H+R、C+Y含量与最适pH的关系
• 6.1.5 瑞氏木霉EGⅡ与已知三级结构的纤维素酶的序列比较
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 纤维素内切酶在糖苷水解酶家族中的分布
• 6.2.2 糖苷水解酶家族5中纤维素内切酶的特征
• 6.2.3 细菌和真核生物中纤维素内切酶氨基酸含量的特征
• 6.2.4 糖苷水解酶家族5中纤维素内切酶的最适pH的预测方程
• 6.2.5 氨基酸对最适pH的影响
• 6.2.6 H+R含量与最适pH的关系
• 6.2.7 C+Y含量与最适pH的关系
• 6.2.8 瑞氏木霉EGⅡ与已知最适pH和三级结构的纤维素内切酶的比较
• 6.3 讨论
• 6.3.1 氨基酸含量对纤维素内切酶最适pH的影响
• 6.3.2 其它因素对纤维素内切酶最适pH的影响
• 6.3.3 展望
• 小结
• 第七节 瑞氏木霉内切葡聚糖酶Ⅱ在黑曲霉中的表达
• 7.1 材料和方法
• 7.1.1 菌株和质粒
• 7.1.2 培养基和培养方法
• 7.1.3 试剂,工具酶与仪器
• 7.1.4 原生质体的制备
• 7.1.5 原生质体的再生及再生率的测定
• 7.1.6 原生质体的转化
• 7.1.7 大肠杆菌转化、质粒的提取及分子克隆操作
• 7.1.8 序列测定与分析
• 7.1.9 蛋白质电泳和活性染色
• 7.1.10 黑曲霉基因组DNA的提取
• 7.1.11 黑曲霉胞外内切葡聚糖酶活性测定
• 7.1.12 Western Blot
• 7.2 结果与讨论
• 7.2.1 菌丝培养方法对原生质体形成的影响
• 7.2.2 菌龄对原生质体形成的影响
• 7.2.3 酶及酶作用时间对原生质形成数量的影响
• 7.2.4 酶解时间对原生质体再生率的影响
• 7.2.5 渗透压稳定剂对原生质体形成和再生的影响
• 7.2.6 原生质体释放的形态学观察
• 7.2.7 再生培养方式的选择
• 7.2.8 转化方法的选择
• 7.2.9 自主复制型载体的构建
• 7.2.10 表达有瑞氏木霉EGⅡ的自主复制型表达载体ANEp7-eg2和表达有瑞氏木霉EGⅡ的整合型表达载体ANIp7-eg2的构建
• 7.2.11 来源于瑞氏木霉的EGⅡ在黑曲霉中的表达
• 7.3 讨论
• 7.3.1 原生质体的制备和转化丝状真菌
• 7.3.2 黑曲霉作为表达宿主表达的重组蛋白
• 7.3.3 展望
• 小结
• 全文总结与展望
• 1 本论文取得的创新性结果
• 2 本论文存在的问题及深入方向
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢
• 附件