通过RNAi技术增强番茄对根结线虫的抗性

论文摘要

植物寄生线虫是一类寄主广泛,严重威胁农作物生产的病原,每年给世界农业生产造成的损失大约1250亿美元（Chitwood,2003）,其危害主要来自根结线虫（Meloidogyne spp.）和孢囊线虫（Heterodera and Globodera spp.）为主的固着型内寄生线虫,特别是根结线虫,其寄主范围广泛,适应性强,传播途径多样。目前生产上主要以化学药剂杀线虫为主,但是化学杀线剂残留时间长、毒性大,严重污染环境。因此通过分子生物学手段选育抗性作物品种是最经济、有效,也是最安全途径。本研究的目的：本研究选取了根结线虫寄生相关的三个基因作为靶基因构建RNAi载体,通过番茄遗传转化,培育稳定株系,并进行转基因植株表型评价,借助RNAi技术,增强转基因番茄对根结线虫的抗性。获得的主要结果如下：1.根据NCBI中已公布的根结线虫Mi-crt （AF402771）、Mi-vap （EF370396）、16D10 （DQ087264）基因序列信息,克隆了3个目标基因的片段,并分别构建了RNAi表达载体。2.利用农杆菌介导的遗传转化方法,将目标基因片段导入番茄品种AC中。PCR检测结果表明,外源基因已整合到番茄基因组中。3.部分转基因植株的RT-PCR分析结果表明,在转基因植株中的根部组织内,寄生根结线虫的3个寄生基因的表达受到明显的抑制。4.转基因植株的根结线虫抗性评价结果显示,To转基因植株有23株获得了根结线虫抗性,并且抗性遗传给了T1代。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略语表
• 1 前言
• 1.1 根结线虫对植物的损害
• 1.2 传统的抗线虫策略
• 1.3 通过分子途径提高植物对根结线虫的抗性
• 1.3.1 抑制线虫的外源活性蛋白介导的植物抗线虫基因工程
• 1.3.2 特异表达启动子介导的抗线虫策略
• 1.3.3 抗线虫基因介导的植物抗线虫基因工程
• 1.4 RNAi的分子作用机制
• 1.5 植物中常用的RNA干扰技术
• 1.5.1 瞬时性的RNAi
• 1.5.2 持久性的RNAi
• 1.6 RNAi干扰技术在植物抗线虫研究中的应用
• 1.7 本研究的目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 植物材料、菌株、质粒、试剂
• 2.2 南方根结线虫寄生基因片段的克隆
• 2.3 RNAi表达载体的构建
• 2.4 番茄遗传转化
• 2.5 转基因番茄植株的分子检测
• 2.6 根结线虫二龄幼虫分离
• 2.7 转化植株的抗性评价
• 2.7.1 根结线虫接种试验
• 2.7.2 目标基因表达量分析
• 2.8 转基因植株T1代分子检测及抗性鉴定
• 3 结果与分析
• 3.1 南方根结线虫寄生基因的克隆与序列分析
• 3.2 RNAi表达载体的构建
• 3.3 转基因植株的获得
• 3.4 转基因番茄植株的分子检测
• 3.5 根结线虫二龄幼虫分离
• 3.6 转基因植株根结线虫抗性鉴定
• 3.6.1 RNAi转植株根结线虫抗性评价
• 3.6.2 目标基因表达量分析
• 3.7 转基因植株T1代分子检测及抗性鉴定
• 4 讨论
• 4.1 转基因植株抗根结线虫的效果
• 4.2 基因功能及作用分析
• 下一步工作
• 参考文献
• 致谢