花桑寄生多糖分离、纯化及抗肿瘤活性的研究

论文摘要

红花桑寄生（Scurrula parasitica L.）是我国南方地区常见的一种桑寄生科植物。前期的研究表明红花桑寄生总黄酮具有良好的体内外抗肿瘤效果。红花桑寄生的同科植物槲寄生（Viscum album L.）在欧洲是一种传统的抗肿瘤植物药,其提取物具有细胞毒、免疫调节等多种抗癌功效,已作为化疗药物的辅助治疗剂常规地用于癌症临床治疗。因此本文研究了红花桑寄生多糖的分离纯化方法、部分理化性质、单用及与环磷酰胺联用的体内抗肿瘤效果,并对其抗肿瘤作用的机制进行了初步探讨。采用单因素及正交实验法确立了提取红花桑寄生多糖（SP）的最佳提取工艺条件和最佳醇沉条件,粗多糖经过DEAE-SephadexA-25柱层析分离,Sephadex G-100凝胶柱层析纯化,得2个主要组分SPⅢ、SPⅣ。应用纯度鉴定、紫外光谱（UV）、红外光谱（IR）等方法分析了多糖的部分理化性质和主要结构特征。建立S180小鼠移植瘤模型检测了SP的体内抗肿瘤作用和对免疫器官重量的影响;选取SP抗肿瘤效果的最佳剂量100 mg/kg.d与环磷酰胺联用,检测SP对环磷酰胺的增效减毒效果。结果表明,SP对S180肉瘤有显著的抑制作用,提高荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数;对环磷酰胺具有显著的协同作用;SP能显著改善环磷酰胺对免疫系统的抑制作用,具有明显的减毒作用。采用免疫组织化学方法检测了S180肉瘤组织中Ki-67、CyclinD1、Bax、Bcl-2等蛋白的表达水平,图像分析系统进行累积光密度的测定,量化蛋白的表达,探讨SP抗肿瘤作用的机制。结果表明,SP抗肿瘤的机制之一是通过下调肿瘤组织中Ki-67、CyclinD1、Bcl-2蛋白的表达,上调Bax的表达,从而抑制瘤细胞的分裂,促进肿瘤细胞的凋亡,抑制肿瘤生长。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 中文文摘
• 第1章 绪论
• 1.1 多糖的研究进展
• 1.1.1 国外多糖的研究进展
• 1.1.2 国内多糖的研究进展
• 1.2 多糖的结构分析
• 1.2.1 多糖的结构分类
• 1.2.2 多糖结构测定方法
• 1.2.2.1 化学方法
• 1.2.2.2 物理方法
• 1.2.2.3 生物学方法
• 1.3 多糖的药理作用研究进展
• 1.3.1 抗肿瘤活性
• 1.3.2 增强免疫活性
• 1.3.3 抗凝血活性
• 1.3.4 抗疲劳活性
• 1.3.5 抗菌活性
• 1.3.6 抗病毒活性
• 1.3.7 抗糖尿病活性
• 1.3.8 降低血压、血脂活性
• 1.4 本论文的研究背景及内容
• 1.4.1 研究背景
• 1.4.2 研究内容
• 第2章 多糖的提取工艺研究
• 2.1 实验材料、仪器
• 2.1.1 材料来源
• 2.1.2 实验仪器
• 2.1.3 试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 原料预处理
• 2.2.2 红花桑寄生多糖的提取
• 2.2.3 红花桑寄生多糖水提工艺研究
• 2.2.3.1 单因素实验
• 2.2.3.2 正交实验
• 2.2.3.3 多糖得率计算
• 2.2.4 红花桑寄生多糖醇沉工艺研究
• 2.2.4.1 单因素实验
• 2.2.4.2 正交实验
• 2.2.5 木瓜蛋白酶法去蛋白工艺研究
• 2.2.5.1 最佳酶用量的确定
• 2.2.5.2 最佳酶解时间的确定
• 2.2.5.3 考马斯亮蓝法测定蛋白含量
• 2.2.5.4 蛋白质标准曲线的绘制
• 2.2.5.5 未知蛋白质测定
• 2.3 实验结果
• 2.3.1 水提工艺的研究结果
• 2.3.1.1 料液比对多糖得率的影响
• 2.3.1.2 提取时间对多糖得率的影响
• 2.3.1.3 提取温度对多糖得率的影响
• 2.3.1.4 提取次数对多糖得率的影响
• 2.3.1.5 水提正交实验结果
• 2.3.2 醇沉工艺的研究结果
• 2.3.2.1 乙醇浓度对醇沉效果的影响
• 2.3.2.2 提取液的浓缩倍数对多糖得率的影响
• 2.3.2.3 醇沉后静置时间对多糖得率的影响
• 2.3.2.4 醇沉正交实验结果
• 2.3.2.5 粗多糖水提醇沉工艺的总结
• 2.3.3 去蛋白工艺的研究结果
• 2.3.3.1 蛋白质含量的测定
• 2.3.3.2 最佳酶用量的确定
• 2.3.3.3 最佳酶解时间的确定
• 2.3.3.4 去蛋白工艺总结
• 2.4 小结与讨论
• 2.4.1 讨论
• 2.4.2 小结
• 第3章 红花桑寄生多糖分离纯化及理化性质鉴定
• 3.1 实验试剂、仪器
• 3.1.1 实验试剂
• 3.1.2 实验仪器
• 3.2 实验方法
• 3.2.1 木瓜蛋白酶+Sevag法脱蛋白
• 3.2.2 透析法去小分子杂质
• 3.2.3 苯酚-硫酸法测多糖含量
• 3.2.3.1 标准溶液的制备
• 3.2.3.2 标准曲线的制备
• 3.2.3.3 样品含量的测定
• 3.2.4 红花桑寄生多糖的纯化
• 3.2.4.1 DEAE-SephadexA-25离子交换柱和葡聚糖Sephadex G-100凝胶柱的预处理
• 3.2.4.2 多糖纯化步骤
• 3.2.5 多糖的纯度鉴定
• 3.3 红花桑寄生多糖理化性质的测定
• 3.3.1 多糖的鉴定
• 3.3.2 多糖含量测定
• 3.3.3 紫外光谱（UV）分析
• 3.3.4 红外光谱（IR）分析
• 3.4 实验结果
• 3.4.1 葡萄糖标准曲线的绘制
• 3.4.2 DEAE-SephadexA-25柱层析结果
• 3.4.3 葡聚糖Sephadex G-100柱层析结果
• 3.4.4 多糖纯度的鉴定
• 3.4.5 多糖的鉴定
• 3.4.6 多糖的含量
• 3.4.7 紫外光谱（UV）分析
• 3.4.8 红外光谱（IR）分析
• 3.5 小结与讨论
• 3.5.1 讨论
• 3.5.2 小结
• 第4章 红花桑寄生多糖的体内抗肿瘤作用
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 实验动物
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 实验仪器
• 4.2 实验方法
• 4.2.1 肿瘤动物模型的建立
• 4.2.2 SP对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用及对免疫器官的影响
• 4.2.3 SP对CTX的增效减毒作用实验
• 4.2.4 组织固定
• 4.2.5 免疫组化法检测瘤组织Ki-67、Cyclin D1、Bax、Bcl-2蛋白的表达
• 4.2.6 免疫组织化学结果判断
• 4.2.7 统计学方法
• 4.3 实验结果
• 4.3.1 SP对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用和对免疫器官的影响
• 4.3.2 SP对CTX的增效减毒作用实验
• 4.3.3 S180瘤组织中Ki-67蛋白的表达
• 4.3.4 S180瘤组织中Cyclin D1蛋白的表达
• 4.3.5 S180瘤组织中Bax蛋白的表达
• 4.3.6 S180瘤组织中Bcl-2蛋白的表达
• 4.4 讨论
• 4.4.1 SP对S180荷瘤小鼠的抗肿瘤作用和对免疫器官的影响
• 4.4.2 SP对CTX的增效减毒作用
• 4.4.3 S180瘤组织中Ki-67蛋白的表达
• 4.4.4 S180瘤组织中Cyclin D1蛋白的表达
• 4.4.5 S180瘤组织中Bax、Bcl-2蛋白的表达
• 4.5 小结
• 结论
• 附录 缩略词表
• 参考文献
• 攻读学位期间承担的科研任务与主要成果
• 致谢
• 个人简历