论文摘要
随着斑马鱼基因组测序工作的完成,人们发现斑马鱼基因与人类基因的保守度高达87%,使得斑马鱼作为一种研究人类基因功能的模式动物越来越受到关注。转座子在低等生物转基因和基因诱变分析中得到了广泛的应用,对这些生物基因功能的研究起了重要作用。目前用于斑马鱼基因功能研究的转座子主要是Tol2,结合基因捕获技术较广泛的被应用于斑马鱼突变体筛选。Tol2的转座遵循“切离-粘贴”机制,其插入基因组时会产生插入位点处8个碱基的重复,但其存在切离后留下的痕迹不一的缺点,不易实现对突变表型的回复。PiggyBac转座子（PB）是一种来源于鳞翅目昆虫的DNA转座子,最初的序列在粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）细胞系中分离,其转座遵循“切离-粘贴”机制,PB特异地插入到TTAA四碱基位点,插入的同时在其两侧形成TTAA四碱基重复。它可以从插入位点处精确地切离,不留下任何痕迹,使插入位点完全回复到插入以前的状态。该转座子目前已经开发成为转基因昆虫中应用最为广泛的载体之一,它已被证明能够在四个目十数种昆虫中转座。2005年Ding等的研究发现其也能在脊椎动物如小鼠中实现高效转座；2006年,Fraser等发现PB转座子在斑马鱼原代培养细胞及胚胎中均能进行转座,揭示了PB转座系统在斑马鱼基因功能研究中具有广泛的应用前景。我们对piggyBac（PB）转座系统中的helper质粒-转座酶载体质粒（pCMV-hyPBase）和donor质粒-转座子载体质粒（5’-PTK-3’）分别进行了重新构建,得到了一个二元系统。Helper质粒pCMV-hyPBase-IRES-EGFP构建过程如下：将来源于质粒pPRIG的IRES-EGFP片段插入到XbaI和XhoI双酶切的质粒pCMV-hyPBase的缺口,从而构建了双顺反子表达载体质粒：pCMV-hyPBase-IRES-EGFP; Helper质粒pZPCO.5-hyPBase-IRES-EGFP构建过程如下：将克隆得到的斑马鱼ZPC0.5启动子插入到SpeI和EcoRI双酶切的质粒pCMV-hyPBase-IRES-EGFP缺口,替换掉CMV启动子,即得到双顺反子表达载体质粒：pZPC0.5-hyPBase-IRES-EGFP。Donor质粒PTK-mCherry构建过程如下：将以pmCherry-N1质粒为模板克隆得到的mCherry基因片段插入到用NcoI和BelI双酶切的质粒5’-PTK-3’缺口,构建得到了基因捕获载体质粒：PTK-mCherry。质粒pCS2+-hyPBase构建过程如下：将来源于质粒pCMV-hyPBase的hyPBase片段插入到用EcoR1和Xho1双酶切的质粒pCS2+的缺口,即构建了转座酶hyPBase mRNA合成模板载体质粒pCS2+-hyPBase。将pCMV-hyPBase-IRES-EGFP质粒载体线性化后显微注射到斑马鱼单细胞期受精卵中,筛选得到了EGFP遍表达的helper品系转基因斑马鱼,并且发现其中一些鱼的这一性状能够稳定传给F1代,从而得到了此转基因品系的founder斑马鱼。以线性化的pCS2+-hyPBase为模板,体外转录合成了转座酶hyPBase mRNA。将此mRNA与基因捕获载体质粒PTK-mCherry共注射到斑马鱼单细胞期受精卵中,筛选得到了mCherry的表达在时间及空间上均不同的donor品系转基因斑马鱼,且发现mCherry在F0代中有将近8%的表达率,证明piggyBac转座子能够在斑马鱼中进行有效转座且捕获到不同基因,因此piggyBac转座系统在斑马鱼中可以作为一种新的技术手段,有效实现突变体的筛选。我们计划通过helper及donor品系斑马鱼的交配策略在下一代中实现在体（in vivo）转座,从而筛选到更多新的突变体,希望PB转座系统的应用能进一步推动解析脊椎动物基因功能的进程,对人类生物学和疾病研究有所帮助。胸腺是脊椎动物中重要的免疫器官,在其发育过程中受多种基因的协调控制,其中pax1,pax9,eya1、sis1、six4,foxnI等的作用最为关键。文昌鱼是无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类群的典型代表,被认为是研究脊椎动物起源和进化的新兴模式动物。以往的观点认为,文昌鱼作为头索动物不存在获得性免疫系统。但最近的研究表明,许多脊椎动物获得性免疫系统中的重要基因如six家族基因在文昌鱼中存在同源或者相似的基因。利用生物信息学分析,我们发现在佛罗里达文昌鱼数据库中存在脊椎动物胸腺发育关键基因pax1,pax9,eya1、six1、six4,foxnI等的同源基因,并对这些同源基因进行了进化学分析；利用青岛文昌鱼与佛罗里达文昌鱼的高度相似性,以佛罗里达文昌鱼数据库中的基因序列为模板设计引物,利用RT-PCR的方法克隆倒了青岛文昌six1基因片段（包含完整CDS）及six4基因片段；对six1基因演绎蛋白序列进行了结构及性质的分析,Six1演绎蛋白长200个氨基酸,理论分子量为22057.6Da,等电点为7.84,是一亲水蛋白,属于homeodomain超家族.