人尿激肽原酶对急性局灶性脑缺血再灌注大鼠细胞凋亡的影响

论文摘要

研究背景脑血管病（CD）是人类死亡的第三大原因,也是致残率最高的疾病之一。1990年全军脑血管病调查组调查结果显示:我国脑卒中的世界人口标准化发病率是115.61/10万,患病率是256.94/10万,死亡率是81.33/10万。据WHO估计,我国即使脑卒中发病率保持稳定,但由于自然人口增加和老龄化因素,脑卒中的年发病数将由目前的180万上升到2030年的540万。其中缺血性脑血管病（ICD）占70%以上。脑缺血后,急性梗死病灶由中心坏死区及周围的缺血半暗带组成。中心坏死区由于完全性缺血,细胞死亡方式以坏死为主,但缺血半暗带由于存在侧支循环,细胞死亡方式以凋亡为主。缺血半暗带神经元凋亡数量可能决定了最终梗死灶的大小。因此,目前治疗缺血性脑血管病的核心是尽早恢复梗塞区脑组织血流,促使缺血半暗带神经元存活,避免其发生凋亡。因而,药物能否抑制急性脑缺血再灌注损伤后神经元发生凋亡是目前研究的热点。细胞凋亡是在生理和病理条件下的一种主动死亡方式,是受细胞内基因和一些细胞外因子调控的生物学过程。Bcl-2蛋白家族及Caspase蛋白家族在调控线粒体激活的细胞内凋亡途径中起重要的作用。Bcl-2蛋白家族包括Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Bcl-XS、Bak、Bid、Bad、Bix等。其中重要的抑制细胞凋亡蛋白是Bcl-2,在缺血后注定要存活的神经元中表达。而重要的促进细胞凋亡的蛋白是Bax,Bcl-2与Bax的比值细胞决定细胞受凋亡刺激后是死亡还是存活。凋亡细胞内转导途径终点是Caspase-3的激活。因此,Caspse-3被认为是凋亡的最重要的执行蛋白,它大量表达可以直接导致细胞死亡。激肽释放酶-激肽系统（KKS）包括激肽释放酶即激肽原酶、激肽原、激肽。激肽原酶根据原始结构、生物化学特性、免疫特征、底物特异性、合成部位及生理功能的不同,分为血浆激肽原酶和组织激肽原酶,两者分别作用于高分子量的激肽原和低分子量的激肽原,产生缓激肽（BK）和胰激肽或血管舒张素。后者在氨基肽酶的作用下失去赖氨酸,成为缓激肽。激肽作为这一系统的终末效应物质,在生理情况下主要以缓激肽的形式存在。激肽通过其B1和B2受体信号传导途径,参与一系列生物学活动。健康组织主要表达缓激肽B2受体,而B1受体含量很低。组织损伤或炎症可诱导B1受体的表达。一般认为缓激肽对生理功能的调节主要通过B2受体介导;B1受体则在组织损伤后的炎症反应中发挥重要作用,如增加血管通透性、介导平滑肌收缩和舒张,细胞增殖等。激肽可在激肽酶Ⅰ和激肽酶Ⅱ的作用下水解失活。KKS各组成部分广泛存在于大脑,提示其参与中枢神经系统病变的调控,具有神经保护作用。人尿激肽原酶（HUK）是从健康男性尿液中提取的一种组织激肽原酶。急性脑缺血再灌注（I/R）损伤后,HUK作用于缺血部位血管细胞被诱导生成B1受体,增加细胞内Ca2+、前列环素和cAMP形成,增加的Ca2+可提高内皮性一氧化碳合酶（eNOS）活性,促进NO产生,选择性扩张缺血脑组织的脑血管,从而改善缺血区脑组织血供。一氧化碳同时具有减轻氧化应激损伤,促进内皮细胞、神经细胞增殖等作用,能有效减少脑缺血再灌注损伤导致的神经功能障碍及梗塞灶形成,减轻神经缺损症状。目前尚无关于药物人尿激肽原酶对急性脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡影响的研究。探讨人尿激肽原酶对脑缺血后细胞凋亡的影响,将有利于进一步明确其除扩张血管、改善血供以外治疗缺血性脑血管病机制,也为其他药物治疗脑缺血提供参考。第一部分人尿激肽原酶对急性局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠梗塞体积影响目的研究HUK大鼠急性局灶性脑缺血再灌注（FCIR）损伤后梗塞灶体积有无影响。方法健康成年雄性SD大鼠18只,采用完全随机设计方法,按每组6只,随机分为假手术组、缺血再灌注（I/R）组、人尿激肽原酶（HUK）处理组。建立急性大脑中动脉闭塞（MCAO）的局灶性脑缺血模型,于缺血90分钟后实现再灌注损伤。大鼠麻醉清醒后,根据Zea longa等5分制标准进行神经缺陷评分:0分:正常,无神经损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2分:向外侧转圈;3分:向对侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。评分结果为1-3分大鼠说明模型成功,纳入实验（假手术组除外）。每组大鼠于再灌注损伤3小时后给予处理。其中,假手术组不予以处理;I/R组给予生理盐水,1.0mL/kg,一次/天;HUK处理组给予17.5×10—3PNAU/kg人尿激肽原酶,1.0mL/kg,一次/天。大鼠于术后24小时直接断头取脑,做2mm厚的冠状切片,脑组织切片置于2%TTC染液中,避光、37℃孵育30min。白色部分为梗塞灶,红色部分为正常脑组织。采用数码照相机拍照后,利用病理图文分析仪测量梗塞面积。根据公式V=t（A1+...An）-（A1+An）t/2,计算梗塞灶体积,其中t为切片厚度,A为梗死面积。采用SPSS 11.5软件进行统计学分析,数据结果用均数±标准差（（?）±s）表示。因为假手术组指标数为零,为避免方差不齐,不参与统计分析。脑梗塞体积测定采用两样本t检验,P＜0.05示差异有显著性。结果假手术组无梗塞灶,HUK处理组与I/R组相比,梗塞体积显著减少,差异有统计学意义,t值为4.864,P=0.001。结论HUK能减少急性FCIR损伤后梗塞灶体积。第二部分人尿激肽原酶对急性局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠细胞凋亡数量及Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的影响目的观察HUK对大鼠FCIR损伤后神经功能缺陷评分及HE染色情况的影响,应用TUNEL法及免疫组化方法观察其对神经元凋亡及相关Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的影响,探讨HUK能否具有通过抑制凋亡,治疗缺血性脑血管病的作用。方法健康成年雄性SD大鼠66只,采用完全随机设计方法,按每组6只,随机分为假手术组（n=6）、I/R组（n=30）及HUK处理组（n=30）,后两组又分为再灌注6h组、12h组、24 h组、72 h组、168 h组共5个亚组,每亚组6只。模型建立及纳入标准同第一部分。同样,大鼠于再灌注损伤3小时后给予处理。其中,假手术组不予以处理;I/R组给予生理盐水,1.0mL/kg,一次/天;HUK处理组给予17.5×10-3pNAU/kg人尿激肽原酶,1.0mL/kg,一次/天。观察指标:1.神经功能缺陷评分:选择假手术组、I/R 72 h组、168 h组,和HUK 72 h、168 h组大鼠于再灌注损伤后6 h、12 h、24 h、48 h、72 h时间点,根据Zea longa等5分制标准进行;2.病理学观察:大鼠于缺血后相应时间点（假手术组于缺血后24小时）,予以10%水合氯醛3ml/1000g麻醉,自心尖灌注生理盐水250mL,再灌注4%多聚甲醛300mL后断头取脑。切取梗塞区脑组织片进行石蜡包埋,制备尾状核层面4μm厚的石蜡切片。HE染色观察神经元形态变化;TUNEL法观察神经元凋亡数量;免疫组化观察Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达情况。采用SPSS 11.5软件进行统计学分析,数据结果用均数士标准差（（?）±s）表示。因为假手术组各项指标数接近零,为避免方差不齐,不参与统计分析。神经功能缺陷评分采用重复测量的方差分析;神经元凋亡数目、Bcl-2、Bax、Casepase-3免疫组化采用析因分析,P＜0.05示差异有显著性。结果1.HUK能够减轻大鼠急性FCIR损伤后神经功能缺陷症状,在24 h、48 h及72 h时间点,HUK处理组与I/R组相比,统计学有显著差异,t值分别为4.022、2.282、5.322,P值分别为0.001、0.010、0.000。2.HUK处理组与I/R组相比神经元变性、缺血、坏死数量明显较少,间质水肿较轻,尤以24 h亚组明显。3.除168 h组外,各时间点HUK处理组与I/R组相比,细胞凋亡数显著减少,细胞Bcl-2蛋白表达增多,细胞Bax蛋白、Caspase-3蛋白表达减少。结论HUK对急性FCIR损伤具有保护作用,其机制可能为损伤后早期（3 d内）通过上调Bcl-2、下调Bax、Caspase-3蛋白表达,抑制细胞凋亡。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 人尿激肽原酶对急性局灶性脑缺血再灌注损伤后梗塞体积的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二章 人尿激肽原酶对急性局灶性脑缺血再灌注损伤后细胞凋亡数量及Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 缩略语对照表
• 综述
• 成果
• 致谢
• 统计学证明