乳牛肝菌液态发酵产多糖的研究

论文摘要

乳牛肝菌（Suillus bovinus）是一种珍稀食用菌,味道鲜美且营养丰富。作者所在实验室前期的研究表明乳牛肝菌含有一种具有多种生理活性的成分——茶氨酸,并且建立了乳牛肝菌液态发酵培养的方法。目前,国内外尚未见到有关乳牛肝菌液态深层发酵产多糖方面的报道,对乳牛肝菌多糖的研究也未见到。鉴于此,本论文对乳牛肝菌发酵产多糖的相关问题进行了初步的研究。首先以乳牛肝菌菌株为材料,采用液体发酵技术,研究了培养基和发酵条件对菌丝体生物量和胞外多糖产量的影响。然后对通过发酵培养得到的乳牛肝菌菌丝体多糖和胞外多糖进行了提取和分离,并对热水提取菌丝体多糖影响因素进行了考察,通过单因素实验和正交实验优化了菌丝体多糖提取工艺。对提取出的菌丝体多糖和胞外多糖进行了初步的纯化,进行了紫外扫描和红外光谱分析。最后研究了乳牛肝菌多糖对胃癌细胞MGC-803的抑制作用。以期为乳牛肝菌发酵多糖的进一步研究提供理论基础和科学依据。主要研究结果有:1.以发酵获取的菌丝体生物量和胞外多糖产量为指标,通过Plackett-Burman（PB）设计筛选发酵培养的主要影响因素,确定了乳牛肝菌液态发酵培养基主要影响因素为玉米粉（P=0.018）、葡萄糖（P=0.020）、MgSO4·7H2O（P=0.040）和葡萄糖（P=0.018）、玉米粉（P=0.019）、MgSO4·7H2O（P=0.049）。初步优化得到的培养基组成为:葡萄糖30.00g/L,玉米粉20.00g/L,蔗糖15.00g/L,酵母粉4.67g/L,KH2PO44.50g/L,MgSO4·7H2O1.50g/L,CaCO31.33g/L,VB1 15 mg/L。2.在PB设计实验的基础上,以胞外多糖产量为指标,运用响应面法（Response Surface Methodology,RSM）的Box-Behnken中心组合设计对筛选出的重要影响因素进一步优化,确定了乳牛肝菌发酵产多糖最适宜的发酵培养基:葡萄糖37.58g/L,玉米粉28.11g/L,蔗糖15.00g/L,酵母粉4.67g/L,KH2PO44.50g/L,MgSO4·7H2O 1.307g/L,CaCO31.33g/L,VB1 15 mg/L。3.通过单因素实验和正交实验,确定了乳牛肝菌液态发酵培养的最优条件为:摇瓶装液量60 ml/250ml、摇床转速180 r/min、发酵培养6天。4.通过单因素实验和正交实验,确定了水法提取发酵菌丝体多糖的最佳提取工艺为:料液比1:40,浸提温度为100℃,提取时间4小时。采用2次提取可以获得较好的多糖提取得率;将浸提液浓缩4倍,加3倍体积95%乙醇进行沉淀可以得到最大的多糖沉淀率。5.乳牛肝菌发酵菌丝体多糖和胞外多糖初步纯化的结果显示菌丝体多糖含有3种多糖组分;胞外多糖含有2种多糖组分。通过紫外扫描显示初步纯化的菌丝体多糖和胞外多糖均较纯,不含核酸、蛋白和色素;红外光谱分析显示菌丝体多糖和胞外多糖都具有多糖特征吸收峰,且胞外多糖的构型主要为β-型吡喃环。6.镜下观察和MTT法检测的结果表明乳牛肝菌发酵菌丝体多糖和胞外多糖对人胃癌细胞MGC-803增值具有一定的抑制作用,且在一定浓度范围内抑制率随着多糖浓度的提高而提高。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 文献综述
• 1.1 食用菌多糖的研究进展
• 1.1.1 食用菌多糖研究概况
• 1.1.2 食用菌多糖的提取、分离和纯化及性质研究
• 1.1.3 食用菌多糖的活性作用研究
• 1.2 食用菌液态发酵技术的研究现状
• 1.3 牛肝菌及其液态发酵产多糖的研究
• 2 引言
• 2.1 课题的立题背景及意义
• 2.2 本研究的主要内容
• 2.3 课题来源
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.2 主要试剂
• 3.3 主要仪器
• 3.4 菌株的活化
• 3.5 种子培养
• 3.6 发酵培养
• 3.7 苯酚--硫酸法测多糖含量
• 3.8 菌丝体干重的测定
• 3.9 胞外粗多糖的测定
• 3.10 乳牛肝菌液态发酵产多糖培养基的优化
• 3.11 发酵条件优化的单因素实验
• 3.12 发酵条件优化的正交实验
• 3.13 菌丝体多糖的水法提取工艺研究
• 3.14 菌丝体多糖的分离提取工艺
• 3.15 发酵液多糖的分离提取工艺
• 3.16 Sevag法脱蛋白
• 3.17 紫外扫描光谱分析
• 3.18 离子交换柱层析
• 3.19 红外光谱分析
• 3.20 乳牛肝菌粗多糖对人胃癌细胞MGC-803生长的抑制作用
• 4 结果与分析
• 4.1 Plackett-Burman实验筛选发酵培养基的主要因素
• 4.2 影响胞外粗多糖产量的主要因素筛选
• 4.3 影响菌丝体产量的主要因素筛选
• 4.4 最陡爬坡实验
• 4.5 响应面实验设计
• 4.6 模型验证实验
• 4.7 发酵条件优化的单因素实验
• 4.8 多糖浸提条件单因素实验结果分析
• 4.9 紫外扫描光谱分析
• 4.10 乳牛肝菌多糖的离子交换柱层析结果
• 4.11 乳牛肝菌发酵多糖红外光谱分析
• 4.12 乳牛肝茵粗多糖对人胃癌细胞MGC.803增殖的影响
• 4.13 细胞的增殖活性变化分析
• 主要结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介
• 攻读硕士学位期间发表的论文