论文摘要
目前在人类和动物的传染病中，结核病仍是危害人畜健康的最严重的传染性疾病。结核病的诊断技术主要有细菌学，免疫学和分子生物学三种诊断方法，其中细菌学检查仍然是结核病实验室诊断的金标准。但该法涂片阳性率低，细菌培养费时间；分子生物学检查虽然快速，灵敏，但操作烦琐，技术要求高，难以广泛运用。免疫学检查的诊断价值虽然不如细菌学检查，但具有简便，快速，又有一定的敏感性和特异性，因此不失为结核病有效诊断的辅助方法。近年来，人们对结核分枝杆菌（MTB）培养的滤液进行了深入的研究，分离出了多种分泌蛋白，如MPT64、PT70、MPT63、MPT53、Ag85、CPF10、ESAT6等。其中的CFP10、ESAT6具有良好的免疫原性，而且为结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌所特有，BCG及非致病分枝杆菌缺乏。因此这两种蛋白有利于区别是否是卡介苗接种过的病畜，是许多研究人员所研究的对象。本研究以结核分枝杆菌标准株H37Rv的基因组DNA为模板，经重叠PCR扩增获得CFP10-ESAT6融合基因片段，克隆于pET21a表达载体中，获得了重组质粒pET21a-CFP10-ESAT6，将其转化大肠杆菌BL21细胞，经IPTG诱导表达，得到了25ku的目的蛋白。Western blot分析重组蛋白的特异性。此后表达产物经纯化和定量分析后免疫新西兰大白兔，通过ELISA方法检测抗体效价水平，高效价抗体用DEAE-32阴离子交换柱纯化后，一部分抗体为包被所用，另外一部分的抗体用辣根过氧化物酶标记后作为检测用，建立双抗体夹心法，并将其用于17种分枝杆菌培养上清和341份临床血清标本的检测，确定该方法的可行性。结果表明：成功构建了CFP10-ESAT6融合基因的原核表达质粒，获得了CFP10-ESAT6融合蛋白。estern blot分析表明，重组蛋白能与结核患者血清发生特异性免疫结合反应，与健康者血清不发生反应。再以此蛋白免疫动物可产生高效价的抗体。抗CFP10-ESAT6多克隆抗体的效价在1：16000稀释后OD450值基本上都达到1.0左右。在纯化和酶标记后，分别以1：1000为包被工作浓度，1：3000为酶标工作浓度时，CFP10-ESAT6的最低检出浓度为25ng／ml，CFP10-ESAT6检测17种分枝杆菌培养上清只有结核分枝杆菌和牛结核分枝杆菌结果为阳性。在与血清反应时的敏感性和特异性分别为40.1％，99.2％。本研究在成功地表达了CFP10-ESAT6融合蛋白的基础上，以结核特异性蛋白免疫兔子获得高效价抗体，建立了双抗体夹心法，该方法对于结核杆菌血清学诊断是切实可行的方法。