肿瘤靶向性TRAIL基因表达载体抗乳腺癌的体外研究

论文摘要

研究目的: 通过双荧光素酶试验检测hTERT启动子在端粒酶阳性人乳腺癌细胞系MCF-7/ADR中的肿瘤特异性转录活性:运用基因重组技术构建hTERT启动子和SV40增强子调控的TRAIL基因表达载体phTERT-TRAIL,并通过RT-PCR、Western blotting、流式细胞术（FCM）的方法检测其在MCF-7/ADR细胞中的肿瘤特异性表达,及通过形态学观察、FCM的PI染色法和AnnexinV-FITC/PI双标法检测其特异性诱导肿瘤细胞凋亡的情况。 研究方法: 1.hTERT启动子靶向性转录活性的检测 以pRL-TK质粒作为内参照,将其与hTERT启动子启动的荧光素酶基因报告质粒phTERTluc1、阳性对照质粒pGL3-Control及阴性对照质粒pGL3-Basic分别共转染端粒酶阳性的MCF-7/ADR细胞和端粒酶阴性的HELF细胞。利用双荧光素酶测试系统,验证hTERT启动子在端粒酶阳性细胞中的特异性转录活性。 2.构建重组载体phTERT-TRAIL和阳性对照载体pSV40-TRAIL 2.1 引物设计及PCR扩增目的基因TRAIL 设计包含HindⅢ和NheⅠ酶切位点的TRAIL特异性引物,以pEGFP-TRAIL为模版,PCR扩增可编码膜结合型TRAIL的长度为862bp的基因片段（含酶切位点）。 2.2 构建重组载体phTERT-TRAIL和阳性对照载体pSV40-TRAIL 将TRAIL基因PCR扩增产物经HindⅢ和NheⅠ酶切、回收后,连接入经HindⅢ和XbaⅠ（NheⅠ的同尾酶）酶切的phTERTluc1中,连接产物转化大肠杆

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 符号说明
• 前言
• 技术路线
• 第一部分 hTERT启动子靶向性转录活性测定及其调控的TRAIL基因表达载体的构建
• 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 质粒、菌株与细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 一般试剂
• 1.4 主要实验仪器
• 2. 方法
• 2.1 phTERTlucl、pGL3-Control、pGL3-Basic的转化、扩增与提取
• 2.1.1 E.coli JM109感受态的制备
• 2.1.2 质粒的转化
• 2.1.3 试剂盒小量提取质粒
• 2.2 细胞的培养、冻存和复苏
• 2.2.1 细胞的培养
• 2.2.2 细胞冻存
• 2.2.3 细胞的复苏
• 2.3 hTERT启动子靶向性转录活性的检测
• 2.3.1 脂质体转染
• 2.3.2 细胞的收集
• 2.3.3 荧光素酶表达量的测定
• 2.4 构建重组载体phTERT-TRAIL和阳性对照载体pSV40-TRAIL
• 2.4.1 引物设计及PCR扩增目的基因TRAIL
• 2.4.2 重组载体phTERT-TRAIL的构建
• 2.4.3 阳性对照载体pSV40-TRAIL的构建
• 结果
• 1. 荧光素酶活性测定分析hTERT启动子靶向性的转录活性
• 2. 重组载体构建流程图
• 3. PCR扩增TRAIL基因
• 4. 重组载体phTERT-TRAIL和阳性对照载体pSV40-TRAIL的构建
• 讨论
• 1. 荧光素酶活性的测定
• 1.1 双荧光素酶报告基因测试系统
• 1.2 pGL3荧光素酶报告基因载体
• 1.3 荧光素酶活性测定分析hTERT启动子靶向性的转录活性
• 1.3.1 端粒酶及其分布特点
• 1.3.2 hTERT启动子的基因结构特点及其活性调控机制
• 1.3.3 hTERT启动子的研究价值及其在乳腺癌中的应用前景
• 2. TRAIL及TRAIL基因表达载体的构建
• 第二部分 外源TRAIL基因在乳腺癌细胞MCF-7/ADR中特异性表达及特异性诱导凋亡的研究
• 材料与方法
• 1. 材料
• 1.1 质粒、细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 一般试剂
• 1.4 主要仪器
• 2. 方法
• 2.1 脂质体转染及转染率的检测
• 2.2 hTERT启动子调控的外源基因TRAIL靶向MCF-7/ADR细胞表达的检测
• 2.2.1 脂质体转染
• 2.2.2 半定量RT-PCR检测各组细胞TRAIL mRNA水平的表达
• 2.2.3 蛋白质印迹试验检测TRAIL蛋白水平的表达
• 2.2.4 FCM检测各组细胞TRAIL蛋白水平的表达
• 2.3 hTERT启动子调控的TRAIL基因特异性诱导细胞凋亡的检测
• 2.3.1 脂质体转染
• 2.3.2 形态学观察
• 2.3.3 PI染色法
• 2.3.4 AnnexinV-FITC/PI法
• 结果
• 1. 脂质体介导的转染率
• 2. TRAIL基因表达的检测
• 2.1 半定量RT-PCR检测TRAIL mRNA的表达水平
• 2.2 Western blotting检测转染细胞TRAIL蛋白水平的表达
• 2.3 FCM检测转染细胞TRAIL蛋白水平的表达
• 3. 转染细胞凋亡情况的检测
• 3.1 外源基因TRAIL转染细胞后的光镜下观察细胞形态学变化
• 3.2 FCM的PI染色法检测TRAIL诱导的细胞凋亡
• 3.3 FCM的Annexin V-FITC/PI双标法检测TRAIL诱导MCF-7/ADR细胞的早期凋亡
• 讨论
• 1. 脂质体转染
• 2. 重组载体phTERT-TRAIL在端粒酶阳性细胞中的特异性表达
• 3 肿瘤靶向性载体特异性诱导乳腺癌细胞的凋亡
• 3.1 TRAIL引起的凋亡通路及其调节机制
• 3.2 TRAIL基因治疗存在的负面效应及重组载体phTERT-TRAIL构建的意义
• 3.3 FCM检测凋亡
• 小结
• 附图
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文及编著目录
• 学位论文评阅及答辩情况表