人卵透明带蛋白3突变体的构建及其在毕赤酵母中的表达

论文摘要

本研究利用重叠延伸PCR介导的定点诱变技术对人卵透明带3（hZP3）序列中三个潜在的酵母蛋白水解酶切割位点进行突变。通过消除这些蛋白酶切位点,希望能得到没有降解的重组hZP3蛋白。此外,本研究的另一个目的就是探讨hZP3序列中的C端跨膜区以及作为纯化标签的多聚组氨酸在目的蛋白中的位置对于巴氏毕赤酵母所表达的重组hZP3蛋白的表达量和纯化过程的影响。天然hZP3的C端跨膜区在分泌途径中已经被切除,并没有出现在成熟肽中,但是由于这段序列的疏水性,可能会对重组蛋白的表达过程产生影响。多聚组氨酸标签的作用是为了方便目的蛋白的纯化,但它在目的蛋白中的位置可能改变蛋白的结构进而影响蛋白的表达和纯化。为此,我们设计实验如下:选用pPIC9K-6×his和pPICZaA作为表达载体。pPIC9K-6×his是由商品化的表达载体pPIC9K改造而成,通过PCR在pPIC9K的SnaBI和EcoRI位点之间插入一段编码6个组氨酸和2个甘氨酸的DNA片断,使表达出来的目的蛋白在N端有6个串联的组氨酸纯化标签。根据C端跨膜区的有无和引入酶切位点的不同,通过重叠延伸PCR构建4个hZP3基因突变体。经过酶切和连接,将突变的hZP3基因片断分别克隆到载体pPIC9K-6×his和pPICZaA中。4个重组质粒经SacI线性化处理后转化入毕赤酵母GS115中表达重组hZP3蛋白。表达产物经SDS-PAGE和Western-blot鉴定分析,结果表明:（1）通过定点诱变消除潜在蛋白酶切位点成功抑制了表达产物的降解;（2）C—端跨膜区和多聚组氨酸标签位置对重组hZP3蛋白的表达并无很大影响;（3）多聚组氨酸标签位置对重组hZP3蛋白的纯化影响也不大。

论文目录

• 一 前言
• 1.1 卵透明带研究概述
• 1.2 毕赤酵母表达系统概述
• 1.3 蛋白质工程与定点诱变技术
• 1.4 本研究课题的立论依据、目的及意义
• 1.5 本研究的技术路线
• 二 实验材料、试剂和仪器
• 2.1 主要材料
• 2.2 主要试剂
• 2.3 主要仪器
• 三 实验方法
• 3.1 重组质粒的构建
• 3.1.1 通过重叠延伸PCR对hZP3基因进行定点诱变
• 3.1.2 表达载体的制备
• 3.1.3 外源基因与载体的双酶切
• 3.1.4 外源基因与载体的连接
• 3.1.5 氯化钙法制备大肠杆菌DH5α和Top10感受态细胞
• 3.1.6 大肠杆菌DH5α和Top10的转化
• 3.1.7 转化子的筛选和鉴定
• 3.2 重组质粒在毕赤酵母中的表达
• 3.2.1 酵母细胞的转化
• 3.2.2 阳性克隆的筛选与表达蛋白的鉴定
• 四 实验结果
• 4.1 重叠延伸PCR介导的hZP3基因的定点诱变
• 4.2 重组质粒的构建及鉴定结果
• 4.3 重组质粒的序列测定结果
• 4.4 毕赤酵母的转化结果
• 4.5 阳性克隆的鉴定结果
• 4.6 多拷贝转化子的筛选
• 4.7 目的蛋白的表达结果
• 五 讨论与小结
• 5.1 重叠延伸PCR介导的定点诱变
• 5.2 重组质粒的构建和鉴定
• 5.3 hZP3基因在毕赤酵母中的表达及其影响因素
• 5.4 小结
• 参考文献
• 附录一 各种试剂的配制方法
• 附录二 全长hZP3 cDNA序列
• 附录三 重组质粒测序结果
• 在校期间发表论文情况
• 致谢