氯通道与胶质瘤发生发展机制的相关性研究

论文摘要

本文在发现人胶质瘤及其他脑肿瘤手术标本中ClC-3蛋白及mRNA高表达,而在正常脑组织中低表达的基础上,对氯通道与胶质瘤细胞增殖和浸润之间关系进行探讨。对不同渗透条件下氨基酸释放量的检测证实,低渗刺激诱导U251MG细胞发生谷氨酸等氨基酸的渗透性外流,而氯通道阻断剂NPPB可使这种外流明显减少。氯通道阻断剂对细胞增殖影响的研究发现,NPPB、DIDS、NFA以及Tamoxifen对U251MG细胞增殖有不同程度的抑制效应,并呈剂量依赖性。流式分析证实NPPB诱导细胞出现G0/G1期阻滞。而且,应用NPPB后24h细胞发生G1/S检查点障碍。Ki-67染色进一步证实NPPB诱导细胞发生G0/G1期阻滞。半定量PCR提示U251MG细胞周期相关基因中p57及CDK6在NPPB作用12h及24h时表达上调,而cyclinD1表达下调。本研究提示氯通道可能参与胶质瘤细胞增殖及浸润过程,并且可能与肿瘤细胞的恶性转化相关。本研究有助于进一步研究氯通道与胶质瘤发生发展的关系,从而完善胶质瘤的分子机制。

论文目录

• 前言
• 第一篇 文献回顾
• 第一章 氯离子通道家族成员及生物学特点
• 第二章 氯通道与肿瘤关系
• 第二篇 实验正文
• 第一章 ClC-3 在人胶质瘤中的表达及分布
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 研究对象
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 引物
• 1.1.4 实验仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 总 RNA 的提取
• 1.2.2 RT-PCR
• 1.2.3 免疫组织化学染色
• 1.2.4 统计学处理
• 2 结果
• 2.1 脑肿瘤中ClC-3 蛋白的表达
• 2.2 脑肿瘤中 ClC-3mRNA 的表达
• 3 讨论
• 4 结论
• 第二章 膨胀激活性氯通道与氨基酸释放的关系
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 实验所用液体的配制
• 1.2.2 U251MG 细胞培养
• 1.2.3 样品制备及测定
• 2 结果
• 2.1 样品色谱图
• 2.2 氨基酸的释放
• 2.2.1 低渗环境下氨基酸的释放
• 2.2.2 NPPB 对低渗刺激下氨基酸释放的影响
• 3 讨论
• 4 结论
• 第三章 氯通道与细胞增殖的关系
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 实验所用常规液体的配制
• 1.2.2 实验操作流程
• 1.2.2.1 MTT 比色试验
• 1.2.2.2 台盼蓝排斥实验
• 1.2.2.3 吖啶澄染色检测凋亡细胞
• 1.2.2.4 流式细胞仪检测
• 1.2.2.5 细胞免疫组织化学染色
• 1.2.3 统计学处理
• 2 结果
• 2.1 MTT 比色实验
• 2.2 台盼蓝排斥实验
• 2.3 吖啶橙染色检测调亡细胞
• 2.4 流式细胞仪检测细胞周期
• 2.5 Ki-67 染色
• 3 讨论
• 4 结论
• 第四章 氯通道阻断剂对细胞周期相关基因的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 细胞株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 PCR 引物
• 1.1.4 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 U251MG 细胞处理
• 1.2.2 提取细胞总RNA
• 1.2.3 RT-PCR
• 1.2.3.1 逆转录
• 1.2.3.2 PCR
• 1.2.4 统计学处理
• 2 结果
• 3 讨论
• 4 结论
• 第五章 结论
• 参考文献
• 攻读博士期间发表文章
• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写词表