论文摘要
DEPTOR是和mTOR相互作用的蛋白其起着抑制mTOR复合物1（mTORC1）、活化mTOR复合物2（mTORC2）的作用。研究显示在大多数肿瘤上DEPTOR的表达水平呈低表达，但同时发现在骨髓瘤细胞系如人骨髓瘤细胞株RPMI-8226中为高表达，并且DEPTOR具有调节磷脂酰肌醇3-激酶PI3K/蛋白激酶B（Akt）信号通路的作用。而PI3K/Akt的活性状态对骨髓瘤细胞的生存是重要的，并且PI3K/Akt信号通路和细胞增殖、分化及凋亡有关，此通路的下游包括caspase-3和caspase-9等。另一方面有研究报道mTORC1和PI3K/Akt有阻断自噬的作用。并且自噬和凋亡的关系在近十多年里被广泛研究和关注。另外有些研究显示阻断自噬可诱导凋亡。因此本研究试图明确DEPTOR在自噬方面存在的作用。并且我们推测干扰DEPTOR基因也许对多发性骨髓瘤的治疗具有重要的意义。本研究旨在探讨DEPTOR在增殖、凋亡和自噬中的作用并试阐明DEPTOR在增强骨髓瘤化疗敏感性方面的机制。第一部分抑制细胞的自噬对化疗药物的抗骨髓瘤活性的影响研究目的：研究自噬特异性抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）对多柔比星（doxorubicin，DOX）处理的骨髓瘤细胞RPMI-8226存活率的影响，并探讨其机制。研究方法：以四甲基偶氮唑蓝（MTT）检测3-MA抑制自噬前后，DOX对RPMI-8226细胞增殖抑制作用的变化；Western blot检测凋亡活化蛋白表达的变化，并用Western blot分别检测自噬相关蛋白LC-3及Atg5的变化，同时透射电镜用于观察自噬体的变化。研究结果：DOX可诱导骨髓瘤细胞RPMI-8226产生自噬，自噬相关蛋白水平表达增加；3-MA与DOX联合作用可明显增强RPMI-8226细胞的凋亡，3-MA抑制DOX诱导的自噬。结论：DOX诱导骨髓瘤细胞RPMI-8226凋亡的过程中自噬起到保护性作用；抑制自噬可明显增强DOX诱导的RPMI-8226细胞凋亡。3-MA可能为提高骨髓瘤对化疗敏感性提供新思路。第二部分靶向人多发性骨髓瘤DEPTOR基因的shRNA慢病毒载体的构建及鉴定研究目的：本研究探讨应用RNA干扰技术构建人DEPTOR基因的shRNA慢病毒载体，并鉴定在多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞上的沉默效果。研究方法：设计4个DEPTOR siRNA序列，化学合成后退火形成双链，克隆到酶切的hU6-MCS-CMV-EGFP（GV115）-shRNA慢病毒载体。重组质粒经PCR测序鉴定后，脂质体介导下转染293T细胞，Western blot检测DEPTOR的表达，筛选出干扰效果最佳的GV115-shRNA。将筛选的GV115-shRNA与慢病毒包装质粒共转染293T细胞生成病毒，收集病毒上清并浓缩，测定浓度。将病毒颗粒感染多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞，应用Real-time PCR方法从mRNA水平及Western blot方法从蛋白水平检测DEPTOR的沉默效果。研究结果：构建的慢病毒载体shRNA的PCR鉴定和测序正确，成功筛选出最有效抑制DEPTOR表达的shRNA2序列，包装病毒后滴度达到1×109TU/ml。慢病毒感染RPMI-8226细胞后可表达EGFP，Real-timePCR和Western blot检测DEPTOR的表达明显下降。结论:成功构建了DEPTORshRNA重组慢病毒载体，其转染多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞后显著抑制了DEPTOR的表达，为探讨DEPTOR在肿瘤基因治疗中的作用奠定了基础。第三部分沉默DEPTOR基因对人多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖、凋亡和自噬的影响研究目的：评价DEPTOR对人多发性骨髓瘤细胞增殖、凋亡和自噬的影响及可能机制。研究方法：通过DEPTOR shRNA转染人多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞，以沉默DEPTOR基因。运用MTT法检测骨髓瘤细胞增殖能力的变化；流式细胞仪检测细胞凋亡；用Western blot分析Cleaved caspase-3和Cleaved PARP的变化。用透射电镜和单丹磺酰戊二胺（MDC）观察自噬体的变化。研究结果：下调DEPTOR基因可显著减慢骨髓瘤细胞的生长速度（P <0.05），肿瘤细胞的凋亡率上升（P <0.05）。DEPTOR shRNA上调Cleaved caspase-3、Cleaved PARP和Bax表达，下调Bcl-2及PI3K Akt信号通路的表达（P <0.05）。另外，在RPMI-8226细胞中下调DEPTOR基因可抑制自噬。结论: DEPTOR shRNA可以有效地抑制骨髓瘤细胞的增殖，诱导细胞的凋亡及抑制细胞自噬。PI3K Akt信号通路可能参与了其凋亡及自噬过程。第四部分DEPTOR shRNA与抗瘤药物联合对多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖和凋亡的影响研究目的：探讨DEPTOR shRNA与抗瘤药物联合对多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖和凋亡的影响及相关机制。研究方法：通过DEPTOR shRNA转染人多发性骨髓瘤RPMI-8226细胞，以沉默DEPTOR基因。转染的细胞用化疗药物处理。运用MTT法检测骨髓瘤细胞增殖能力的变化；流式细胞仪检测细胞凋亡；用Westernblot分析凋亡有关蛋白、自噬相关蛋白及PI3K/Akt信号通路蛋白的变化。用透射电镜和MDC观察自噬体的变化。研究结果：下调DEPTOR基因可增强化疗药物诱导的细胞阻滞和凋亡（P <0.05），增加凋亡相关蛋白（Cleaved caspase-3、Cleaved PARP）的表达和抑制自噬相关蛋白表达（P <0.05）。另外，在RPMI-8226细胞中下调DEPTOR基因抑制PI3K Akt信号通路的表达（P <0.05）。结论: DEPTORshRNA通过阻断PI3K/Akt活性可增强抗瘤药物对骨髓瘤细胞增殖的抑制，增加骨髓瘤细胞的凋亡。
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相关论文文献
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