LYVE-1的基因克隆及其在巴斯德毕赤酵母细胞中的表达及分离纯化的研究

论文摘要

淋巴管内皮特异性透明质酸受体（lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor,LYVE-1）是一种特异性较高的淋巴管内皮特异性受体。利用LYVE-1作为特异的淋巴管内皮标志物研究肿瘤淋巴管新生是近年肿瘤研究领域的一个新热点。目前很多报道认为肿瘤中LYVE-1的表达与淋巴结转移有密切关系。因此,利用LYVE-1抗体进行肿瘤转移的诊断可能具有较大的临床应用潜力。LYVE-1由于与HA跨膜转运有关,而HA参与了肿瘤细胞的转运,因此LYVE-1很可能也在肿瘤转移中发生某种调节作用。用基因工程的方法生产LYVE-1,可解决天然分子来源不足的缺点,克服大肠杆菌等原核表达体系无翻译后修饰的不足,提供一种较为接近人体天然蛋白的表达方式,为其在肿瘤转移中的机制、临床诊断及治疗的研究提供方便。巴斯德毕赤酵母是一种甲醇酵母,可以在以甲醇为唯一碳源和能源的培养基中生长。在表达真核细胞外源蛋白时,不仅具有原核生物生长快、操作简便、成本低的特点,又具备哺乳类动物细胞的翻译后加工和修饰的功能,从而表达有生物活性的蛋白。目前人们已利用毕赤酵母系统成功表达了许多外源蛋白,但至今尚无表达LYVE-1的报道。为研究LYVE-1用于肿瘤及其淋巴转移诊断及治疗的可能性,我们进行了人LYVE-1的基因克隆,并在巴斯德毕赤酵母中进行了表达和鉴定。首先,完成人LYVE-1的基因克隆。用Trizol法提取新鲜结肠癌根治术中所取转移淋巴结的总RNA,RT-PCR获得LYVE-1的全长cDNA。经琼脂糖凝胶电泳及测序证实其与人LYVE-1的全长cDNA序列一致,可以用于表达重组子的构建。其次,构建pPICZαC-LYVE-1重组质粒并转化酵母菌。T4连接酶连接用EcoRⅠ、NotⅠ酶切好的LYVE-1全长cDNA及pPICZαC载体质粒,SacⅠ单酶切线性化重组子,通过BIORADE电转化仪将其转化入已制备为感受态的GS115宿主菌,转化后菌液涂布于YPDS板上生长并挑选阳性克隆鉴定。最后,用巴斯德毕赤酵母表达人LYVE-1蛋白并纯化。工程菌扩增后用1%甲醇诱导目的蛋白表达,通过金属鳌合亲和层析（MCAC）获得纯化的C端带有His-Tag的重组蛋白。经SDS-PAGE及Western bloting检测,表明LYVE-1基因在酵母细胞质中获得了可溶性表达,并且所表达的蛋白具有天然LYVE-1的抗原活性。本研究成功地克隆了人LYVE-1基因,并利用巴斯德毕赤酵母真核表达体系体外大量表达了较为接近人体天然分子结构并具有其抗原活性的LYVE-1蛋白,为进一步应用LYVE-1进行肿瘤的免疫学诊断及临床治疗奠定了实验基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 主要符号及缩略语
• 第一章 绪论
• 1. 淋巴管形成与肿瘤转移
• 2. LYVE-1 及其在肿瘤淋巴转移研究中的作用
• 3.巴斯德毕赤酵母表达体系
• 第二章 人LYVE-1 的基因克隆及重组子构建
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三章 LYVE-1 分子在巴斯德毕赤酵母细胞中的表达纯化
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 论文总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录:综述 LYVE-1 在肿瘤淋巴转移研究中的进展 陶蕾 综述 高锋 审校
• 研究生期间发表的论文