葡萄糖再灌注诱导的人脐静脉内皮细胞氧化损伤与线粒体功能障碍的关系

论文摘要

糖尿病是近年来严重危害人类健康的慢性代谢性疾病,其中糖尿病血管并发症是糖尿病的主要致残及致死原因。如何减少和延缓糖尿病患者血管并发症的发生和发展迫在眉睫。控制血糖是糖尿病治疗的首要措施,但在降糖过程中,难以避免的低血糖会减少降糖益处,甚至可能增加死亡风险。近期大规模强化降糖研究结果提示,强化降糖与严重低血糖发生率增加密切相关；强化降糖不但没有减少心血管疾病的发生率,反而增加了全因死亡率。因此,强化血糖控制引起的低血糖可能也是导致心血管疾病风险增加的一个重要因素。既往研究显示,低糖可以直接损伤神经细胞、胰岛细胞和肿瘤细胞,其损伤机制与氧化应激有关。我科前期研究也提示低糖能够诱导氧化应激而直接导致损伤了内皮细胞ECV304。因此,低血糖对机体的危害值得引起临床医生的高度重视。低血糖后及时给予葡萄糖是临床医生的积极对症处理手段。但近年来国外有研究显示,低糖后给予葡萄糖再灌注可以直接导致神经细胞氧化应激损伤,而且这种损伤作用明显高于低糖本身。我们将这种低糖后再补充葡萄糖导致的细胞或组织损伤称为葡萄糖再灌注损伤（Glucose-reperfusion injury）。目前普遍认为血管性疾病的发生与内皮细胞的功能障碍有着密切的联系。如前所述,低血糖可显著增加糖尿病心血管事件的发生。而且我科既往研究已经提示低糖能够诱导氧化应激水平升高而直接损伤内皮细胞ECV304。那么低糖后给予葡萄糖再灌注是否可诱导和（或）进一步加重内皮细胞功能损伤,从而导致血管性疾病发病风险增加,目前尚未见此类报道。大量研究证实内皮细胞功能障碍与氧化应激相关。氧化应激的产物活性氧（ROS）主要包括超氧阴离子自由基（02-）、过氧化氢（H202）、羟基自由基（OH·）、一氧化氮（NO）等。ROS过多可直接引起细胞膜脂质过氧化反应、蛋白质变性胶连、DNA断裂,引起内皮细胞损伤和功能障碍。ROS过多还可以导致低密度脂蛋白（LDL）被氧化修饰成氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）, ox-LDL对内皮细胞有细胞毒作用。线粒体是细胞内活性氧的重要来源之一。电子经过线粒体呼吸链传递时,质子（H+）顺浓度梯度回流至线粒体内膜的基质侧,产生线粒体膜电位,以此储存能量。线粒体跨膜电位对维持线粒体正常功能是必要的,是研究线粒体功能及其氧化应激损伤的一个重要指标。国外研究表明,氧化应激水平与线粒体膜电位水平呈正相关；使质子返流入基质能降低膜电位,导致线粒体ROS的形成大量减少。生理状态下,大多数电子经过呼吸链传递并最终与氧和质子形成水；小部分电子从呼吸链的底物端漏出直接还原氧分子形成超氧阴离子（02-）。线粒体在正常生理状态下产生少量的活性氧用于维护细胞的正常的生理功能。但在病理条件下,线粒体呼吸链电子传递阻力增大,致使电子发生泄漏而产生大量ROS,活性氧生成过多会引起细胞损伤。在正常情况下,过多的活性氧可被机体的抗氧化防御系统所清除；病理条件下体内的抗氧化酶活性明显下降,抗氧化防御机制被攻溃,由此会加剧氧化应激对机体的损伤。超氧化物歧化酶（SOD）作为重要的抗氧化酶,能够与超氧阴离子相结合并与其发生歧化反应,使其变为无活性的产物。越来越多的研究结果表明,病理条件下SOD因发挥抗氧化作用而造成其活性下降。在真核生物中,位于线粒体内的MnSOD凭借其特殊的位置成为防护线粒体氧化损伤的第一道防线,因而研究MnSOD的活性变化具有重要意义。综上所述,在高糖、低糖等条件下可诱导氧化应激水平升高从而介导内皮细胞损伤。那么葡萄糖再灌注是否同样可导致内皮细胞氧化应激损伤呢?这种损伤作用和线粒体的关系如何呢?目前关于这方面的研究未见报道。本课题以人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12细胞作为内皮细胞研究模型,观察葡萄糖再灌注条件下HUVEC-12细胞内ROS产量和线粒体功能的改变,以期探索葡萄糖再灌注对内皮细胞的损伤作用及其可能机制,为保护内皮细胞的研究提供新的思路。第1章葡萄糖再灌注诱导氧化应激损伤对人脐静脉内皮细胞功能的影响[目的]观察葡萄糖再灌注条件下HUVEC-12细胞内NO含量和ROS含量的变化,初步探讨葡萄糖再灌注对内皮细胞的损伤作用与氧化应激的关系。[研究对象和方法]1、以人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12细胞为研究对象,采用10%胎牛血清的RPMI1640完全培养基培养,置于37.5℃,5%C02饱和湿度培养箱内。2、葡萄糖再灌注实验分为7组：①正常对照组（5.5mM组,细胞培养于葡萄糖浓度为5.5mM的RPMI1640完全培养基中）②持续无糖组（0mM组,细胞培养于葡萄糖浓度为0mM的RPMI1640完全培养基中）③葡萄糖再灌注Ⅰ组（0-5.5 mM组,细胞培养于葡萄糖浓度为0mM的RPMI1640完全培养基中2h,5.5mM葡萄糖再灌注15min）④葡萄糖再灌注Ⅱ组（0-11.1 mM组,细胞培养于葡萄糖浓度为0mM的RPMI1640完全培养基中2h,11.1mM葡萄糖再灌注15min）⑤葡萄糖再灌注Ⅲ组（0-25 mM组,细胞培养于葡萄糖浓度为0mM的RPMI1640完全培养基中2h,25mM葡萄糖再灌注15mmin）⑥持续高糖Ⅰ组（11.1mM组,细胞培养于葡萄糖浓度为11.1mM的RPMI1640完全培养基中）⑦持续高糖Ⅱ组（25mmM组,细胞培养于葡萄糖浓度为25mmM的RPMI1640完全培养基中）以上各组正式干预前均采用无血清培养基培养24小时,以保持各组细胞同步化生长,各组均干预2小时15分钟。3、细胞上清总一氧化氮（NO）含量检测：采用硝酸酶还原法测定NO2-/NO3-水平,严格按照试剂盒的说明进行。4、细胞内ROS水平测定：HUVE-12细胞以每孔2×104种于十二孔板,采用超氧阴离子荧光探针Dihydroethidium （DHE）标记细胞,37℃孵育1h后用PBS缓冲液洗涤3次,立即用微孔板检测系统（SpectraMax M5/M5e）在激发波535nm,发射波610nm测定细胞在不同浓度葡萄糖干预后,在不同时间的细胞内荧光量的变化,间接反映ROS产量。5、统计学处理：各组数据应用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据计量资料采用均数±标准差（x±s）表示,多组资料比较采用单向方差分析（One-way ANOVA）。若差异有显著性,任意两组间比较当满足方差齐性时采用LSD法（Least-significant difference test）。,不满足方差齐性要求时用Tamhane’s T 2法进行检验。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1、各组细胞NO含量：5.5mM组、0mM组、0-5.5mM组、0-11.1mM组、0-25mmM组、11.1mM组、25mM组的NO含量分别是103.63±5.82、45.06±2.73、105.56±5.10、19.57±1.60、17.47±1.74、29.45±0.74、26.35±6.28。不同干预条件下各组间NO含量差异有统计学意义（F=277.305,P=0.000）；与5.5mM组相比,0-11.1mM组、0-25mM组NO含量均显著下降（P均<0.000）：且0-11.1mM组NO含量显著低于0mM组和11.1mM组（P均-0.01）；0-25mM组NO含量显著低于0mM组和25mM组（P均<0.05）2、各组细胞ROS产量：5.5mM组、0mM组、0-5.5mM组、0-11.1mM组、0-25mM组、11.1mM组、25mM组的ROS产量分别是0.56±0.06、0.88±0.07、0.66±0.08、0.67±0.16、1.35±0.12、0.47±0.06、0.82±0.26。不同干预条件下各组间ROS产量差异有统计学意义（F=13.993,P=0.000）；随着葡萄糖再灌注浓度的升高,与0-5.5mM组和0-11.1mM组比较,0-25mM组ROS产量显著增加（P均=0.000）；且0-25mM组ROS产量显著高于0mM组、11.1mM组和25mM组（P均<0.01）[结论]1、葡萄糖再灌注导致细胞内NO含量显著降低,提示葡萄糖再灌注可导致内皮细胞功能障碍。2、葡萄糖再灌注可诱导内皮细胞氧化应激水平升高。与持续低糖组和持续高糖组相比,葡萄糖再灌注组ROS产量升高更明显。这一结果与葡萄糖再灌注导致的内皮细胞内NO含量变化呈负相关,提示葡萄糖再灌注可能通过诱导氧化应激介导内皮细胞功能障碍。第2章葡萄糖再灌注诱导人脐静脉内皮细胞氧化应激的机制与线粒体功能的关系[目的]观察葡萄糖再灌注条件下HUVEC-12细胞ROS产量、线粒体膜电位（MMP）和线粒体超氧化物歧化酶（MnSOD）活性的变化,然后通过调节线粒体膜电位,观察ROS含量和MnSOD活性的变化,初步探讨线粒体功能改变对内皮细胞氧化应激的影响。[研究对象和方法]1、研究对象同第一章。2、实验分组：将HUVEC-12细胞正常培养24小时后,换用无血清培养基培养24小时（血清饥饿）保持细胞同步生长,待细胞至对数期后,开始用不同的完全培养基干预细胞,实验分为两部分：第一部分：①正常对照组（5.5mM组,细胞培养于葡萄糖浓度为5.5mM的RPMI1640完全培养基中）②葡萄糖再灌注Ⅰ组（0-5.5mM组,细胞培养于葡萄糖浓度为0mM的RPMI1640完全培养基中2h,5.5mM葡萄糖再灌注）③葡萄糖再灌注Ⅱ组（0-11.1mM组,细胞培养于葡萄糖浓度为0mM的RPMI1640完全培养基中2h,11.1mM葡萄糖再灌注）④葡萄糖再灌注Ⅲ组（0-25mmM组,细胞培养于葡萄糖浓度为0mM的RPMI1640完全培养基中2h,25mM葡萄糖再灌注）每组均于再灌注后的5min, 10min,15min时间点检测ROS产量和MMP水平；同时在再灌注后15min检测MnSOD活性。第二部分：①正常对照组（5.5mM组,细胞培养于葡萄糖浓度为5.5mmM的RPMI1640完全培养基中）②葡萄糖再灌注A组（0-25mM组,细胞培养于葡萄糖浓度为0mM的RPMI1640完全培养基中2h,25mM葡萄糖再灌注）③葡萄糖再灌注B组（0-25mM+CCCP组,细胞培养于葡萄糖浓度为0mM的RPMI1640完全培养基中2h,25mM葡萄糖再灌注+解耦联剂CCCP 0.05μM）每组各组均干预2小时15分钟,于再灌注后的15min检测ROS产量、MMP水平和MnSOD活性。3、细胞内ROS产量测定同第一章。4、线粒体膜电位（MMP）测定：采用荧光探针Rhodamine 123测定法检测方法严格按试剂盒说明书要求进行。细胞接种于12孔板,调整细胞个数为2×104。经过干预处理后,移除培养基,加入含有1%荧光探针基础培养液,置于37.5℃,5%C02饱和湿度培养箱孵育1h, PBS洗三遍,在激发波长为508 nm,发射波长529nm条件下,用微孔板检测系统（SpectraMax M5/M5e）检测各样本平均荧光强度（MFI）。5、线粒体超氧化物歧化酶（MnSOD）活性检测：采用黄嘌呤氧化酶检测法,严格按照试剂盒的说明进行。6、统计学处理：采用SPSS13.0统计软件进行分析,实验数据以均数±标准差（x±s）表示,2小时15分钟内的ROS产量和MMP水平采用连续性重复测量的方差分析,并考虑交互效应及主效应影响；若交互效应显著,则进一步两两比较分析。多组资料比较采用单向方差分析（One-way ANOVA）,进一步多重比较采用LSD法。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1、0-25mM组与5.5mM组、0-5.5mM组、0-11.1mM组相比,ROS产量和MMP水平升高显著（P均<0.000）,且随着再灌注时间的延长,ROS产量和MMP水平逐渐升高,15min升至最高水平。而0-25mM+CCCP组与0-25mM组相比,ROS产量和MMP水平分别下降17%（P<0.05）、45%（P=0.001）。2、MnSOD活性的变化：与5.5mM组相比,0-5.5mM组、0-11.1mM组、0-25mmM组的MnSOD活性分别下降11%、12%、25%（P均<0.05）,且0-25mM组与0-5.5mM组、0-11.1mM组相比,MnSOD活性下降显著（P均<0.01）；而0-25mM+CCCP组与0-25mM组相比,MnSOD活性显著升高23%（P<0.01）。[结论]1、葡萄糖再灌注可导致线粒体膜电位水平明显升高。2、葡萄糖再灌注条件下,线粒体膜电位水平与该条件下诱导产生的ROS含量呈正相关。提示：葡萄糖再灌注可能通过影响线粒体膜电位诱导内皮细胞内ROS生成增多。3、葡萄糖再灌注可导致MnSOD活性明显下降。4、通过调节MMP的水平,葡萄糖再灌注组ROS产量和MnSOD活性均有显著下降。提示：线粒体功能改变可能是葡萄糖再灌注导致细胞内氧化应激水平升高的一个重要机制之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一章 葡萄糖再灌注诱导氧化应激损伤对人脐静脉内皮细胞功能的影响
• 1.1 材料和方法
• 1.1.1 材料
• 1.1.2 实验方法及步骤
• 1.1.3 统计学处理
• 1.2 实验结果
• 1.2.1 人脐静脉内皮细胞株HUVEC-12的形态观察
• 1.2.2 实验各组对HUVEC-12细胞NO含量的影响
• 1.2.3 各组间ROS产量的比较
• 1.3 讨论
• 第二章 葡萄糖再灌注诱导人脐静脉内皮细胞氧化应激的机制与线粒体功能的关系
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 实验方法及步骤
• 2.1.3 统计学处理
• 2.2 结果
• 2.2.1 实验各组的ROS产量比较
• 2.2.2 实验各组的MMP水平比较
• 2.2.3 实验各组的MnSOD活性比较
• 2.3 讨论
• 小结
• 参考文献
• 中英文缩略词表
• 致谢
• 统计学证明