论文摘要
病毒性心肌炎（VMC）是常见的心血管疾病,其中以柯萨奇病毒B3（CVB3）感染最为常见,除可导致猝死外,部分患者还可以发展为扩张型心肌病（DCM）。VMC发病过程中心肌损伤的机制与病毒直接损伤、炎性因子对心肌的损伤和病毒感染后引起免疫介导的心肌损伤有关,包括自身免疫反应。尽管已有研究表明VMC的免疫损伤机制可能是由Th1/Th2细胞介导,但就这两个细胞亚群的研究并不能完全解释其发病机制。Th17细胞是一种新发现的CD4+T辅助细胞亚群,以分泌IL-17为特征。研究表明,Th17细胞参与了人和动物多种自身免疫性疾病的发病过程。目前动物实验及临床研究均提示Th17细胞亚群及其效应分子IL-17可能参与了VMC的发病过程。但在VMC发病过程中Th17细胞的变化规律如何?相关细胞因子变化及其相互关系如何?哪种信号传导通路介导了VMC中Th17细胞的分化?目前无相关研究。为进一步了解Th17细胞在VMC发病过程中的变化,阐明Th17细胞在VMC中的作用、寻求VMC新的治疗靶点,本课题应用BALB/C小鼠腹腔注射CVB3建立VMC小鼠模型,进行以下四方面研究。第一部分小鼠VMC不同时期Th17细胞及其相关因子变化规律目的:观察小鼠VMC发病过程中Th17细胞及其相关细胞因子IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α的动态演变,探讨Th17细胞及其细胞因子在VMC中的作用及意义。方法:78只6周龄雄性BALB/c小鼠随机分为VMC组（n=48）及对照组（n=30）。两组动物均设0、1、2、3、4、6周6个时点亚组,VMC组每个时点亚组8只。对照组每个时点亚组5只。采用腹腔接种CVB3建立VMC模型（VMC组）,对照组（Control组）腹腔注射等量的PBS液,各组小鼠在规定时点取血,分离血浆,无菌取心脏和脾。HE染色了解心肌病理组织学改变并计算心肌病理积分、流式细胞术（FCS）检测小鼠脾Th17细胞数、RT-PCR检测心肌组织Th17相关细胞因子IL-17、IL-23、IL-6、TNF-αmRNA的表达,免疫组织化学检测小鼠心室肌组织IL-17蛋白表达水平,ELISA检测血清中IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α蛋白的表达。结果:VMC组小鼠第1周开始心肌组织病理积分升高（1.8±0.5）,第2周达峰值（2.8±0.4）,第3周降低,与对照组相应时点亚组比较差异有显著性（P<0.05）。对照组各时点亚组无明显差异（P>0.05）。CVB3感染1周时,Th17细胞即开始升高（2.23±0.89%）,峰值在4周时出现（5.00±0.81%）,并维持升高趋势至6周（2.35±0.35%）,除0周时点外,VMC组Th17细胞比例均高于对照组相应时点（P<0.01）。对照组各时点亚组无明显差异（P>0.05）。VMC小鼠1周时心肌组织IL-17 mRNA开始升高,4周时IL-17 mRNA达峰值,并一直持续至6周。除0周时点外,VMC组其他时点IL-17 mRNA与看家基因β-actin灰度值（OD）比均高于对照组（P<0.01）。对照组各时点亚组无明显差异（P>0.05）。免疫组化结果显示,VMC小鼠心室肌组织中IL-17蛋白在感染1周时开始表达,4周时达峰值,6周时仍高于对照组。除0周时点外,VMC组其他时点IL-17蛋白表达量均高于对照组（P<0.01）。对照组各时点亚组无明显差异（P>0.05）。VMC组小鼠血清中IL-17浓度在第1周升高,4周时达峰值,6周呈现下降趋势。除0周时点外,VMC组其他时点IL-17蛋白表达量均高于对照组（P<0.01）。对照组各时点亚组无明显差异（P>0.05）。IL-23mRNA及蛋白表达规律与IL-17相似,即表现为:在第1周时升高,4周时达峰值,6周呈现下降趋势。小鼠心肌组织中IL-6和TNF-α的mRNA及血清中相应蛋白均在第1周时升高,至2周时达峰值,并维持至6周。除0周时点外,VMC组其他时点IL-6、TNF-α灰度比均高于对照组（P<0.05）。结论:VMC小鼠1-6周Th17细胞及其相关细胞因子IL-17、IL-23、IL-6、TNF-α呈现高表达,提示Th17细胞及其相关因子可能参与了VMC的发病。第二部分:抗IL-17单克隆抗体对小鼠VMC的干预作用目的:观察体内拮抗IL-17后对小鼠VMC的干预作用,从而进一步确定Th17细胞及其效应因子IL-17在VMC中的作用。方法:6周龄雄性BABL/c小鼠32只,随机分成4组,IL-17单克隆抗体组（IL-17mAb组）、同型对照组（Isotype组）、PBS组和正常BABL/c小鼠组（normal组）。IL-17mAb（n=8）、Isotype（n=8）和PBS组（n=8）小鼠均腹腔注射含100TCID50CVB3病毒0.1ml/只,在接种病毒后第4、7、10天,IL-17mAb、Isotype和PBS组小鼠分别腹腔注射100μg/0.1ml IL-17mAb、Isotype和PBS,正常组（n=8）不注射病毒,也不予任何干预。第14天时用Kaplan-Meier生存曲线评估各组小鼠生存率的变化、HE染色了解心肌病理改变、RT-PCR检测小鼠心肌组织IL-17、IL-23、IL-6和TNF-αmRNA的表达、免疫组织化学检测小鼠心室肌组织IL-17的表达水平,ELISA检测血清中IL-17、IL-23、IL-6和TNF-α的蛋白表达、FCS检测各组小鼠脾Th17细胞数变化。结果:IL-17mAb可改善VMC小鼠生存率、降低心脏重量/体重（HW/BW）比值、减少心肌组织内炎性浸润灶、降低心肌病理积分。同时减少心肌中IL-17蛋白的表达、降低血清中IL-17的水平,但不影响心肌组织IL-17mRNA及IL-6、IL-23、TNF-αmRNA及血清中蛋白的表达,也不影响脾Th17亚群细胞的增殖。结论:在小鼠VMC 4天时给予IL-17抗体干预,可减轻心肌炎症、改善小鼠的生存率,进一步验证Th17/IL-17参与了VMC的发生发展。第三部分:细胞因子对VMC小鼠脾Th17细胞的影响目的:观察不同细胞因子对VMC小鼠脾中已分化的Th17细胞增殖作用的影响。方法:6周龄雄性BALB/c腹腔接种CVB3建立VMC小鼠模型,1周后无菌取脾,磁珠分离CD4+T细胞,分别用rIL-23（10ng/ml）、TGF-β（10ng/ml）、TGF-β（10ng/ml）+IL-6（20ng/ml）和TGF-β（10ng/ml）+IL-6（20ng/ml）+rIL-23（10ng/ml）进行体外刺激培养,FCS检测培养后Th17细胞数、RT-PCR检测培养细胞IL-17mRNA的表达、ELISA检测培养上清液中IL-17的变化。结果:与TGF-β单独或联合IL-6刺激比较,rIL-23刺激能显著增加Th17细胞数,培养细胞中IL-17 mRNA表达及培养上清液中IL-17浓度增加（P<0.05）。而TGF-β（10ng/ml）单独或联合IL-6（20ng/ml）刺激均不能增加培养细胞的Th17细胞数（P>0.05）,培养细胞中IL-17 mRNA表达及培养上清液中IL-17浓度也无明显增加（P>0.05）。结论:rIL-23能促进已分化的Th17细胞增殖,而TGF-β和/或IL-6单独或联合刺激不能促进已分化的Th17细胞增殖。第四部分:STAT3信号通路在小鼠VMC Th17细胞分化中的作用目的:观察小鼠VMC中STAT3信号通路的表达及对Th17细胞分化的影响。方法:在小鼠VMC不同时期STAT3信号通路的表达研究中（小鼠分组取材同第一部分研究一）,RT-PCR检测小鼠心肌组织STAT3 mRNA的表达,Western Blot技术检测VMC小鼠心肌组织中p-STAT3的相对含量。VMC1周小鼠无菌取脾,磁珠分离CD4+T细胞后进行体外细胞培养,培养液中分别加入或不加STAT3抑制剂（S3I-201,100uM）。培养48小时后收集细胞,FCS检测培养后Th17细胞数变化,应用RT-PCR检测培养细胞中IL-17、STAT3 mRNA的表达,ELISA检测培养上清液中IL-17的变化。结果:与对照组比较,VMC小鼠在接种病毒后第1周,心室肌组织STAT3 mRNA表达升高,4周时达峰值,至6周时仍高于对照组（P<0.05）。对照组各时点亚组无明显差异（P>0.05）。Western Blot结果显示,VMC小鼠在接种病毒后第1周,心室肌组织p-STAT3表达增加,4周时达峰值,至6周时仍高于对照组（P<0.05）。对照组各时点亚组比较无统计学差异（P>0.05）。S3I-201能抑制Th17细胞的增殖（5.02±1.06%比3.85±0.94%,P<0.05）,培养细胞IL-17 mRNA表达下降、培养上清液中IL-17浓度降低（P<0.05）。结论:小鼠VMC发病过程中存在STAT3通路的激活,应用STAT3特异性抑制剂S3I-201能抑制Th17细胞的增殖。本课题研究结果显示:（1）VMC小鼠1-6周,Th17细胞比例升高,伴有其相关细胞因子IL-17、IL-23、IL-6、TNF-αmRNA及蛋白表达上调,其中Th17细胞比例和IL-17、IL-23 mRNA及蛋白表达高峰在4周出现,IL-6、TNF-αmRNA及蛋白表达高峰在2周出现,均维持较高水平至6周,提示Th17细胞及其相关细胞因子可能参与VMC发病过程;（2） IL-17单克隆抗体可部分改善VMC小鼠心肌病理变化,增加生存率;（3） rIL-23是VMC小鼠脾中已分化的Th17细胞增殖的必须细胞因子,TGF-β单独或联合IL-6刺激对已分化的Th17细胞无增殖作用。⑷STAT3信号转导通路介导了VMC小鼠Th17细胞亚群的分化与增殖。