论文摘要
背景和目的急性白血病是血液系统的恶性克隆性疾病,是青壮年多发的恶性肿瘤。对它的发病机制的相关探讨,一直是科学研究的主要的领域。CD74/P65/TAp63通路被认为是一个新的抗凋亡途径,在细胞凋亡调节中发挥重要作用。CD74是-种2型跨膜蛋白,在细胞膜与MHC-Ⅱ类分子结合,形成CD74复合物转运到核内体和溶酶体,进而激活NF-κB家族成员P65。CD74通过介导P65/RelA二聚体及其共激活因子的转录活性,P65的活化可以上调P53相关联的TAP63蛋白的表达,活化BCL-2基因,诱导BCL-2蛋白质的生成,提高了细胞的存活能力。CD74表达于多种恶性肿瘤。P65在乳腺癌,胃癌,结肠直肠癌等恶性肿瘤高表达。但是CD74及P65在急性白血病原代细胞中的表达及其在急性白血病发病机制中的作用有待进一步探讨。本文采用RT-PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction）法检测49例急性白血病骨髓单个核细胞中CD74 mRNA和P65mRNA的表达,分析其相关性,并与24例完全缓解者和12例非恶性血液病的对照者骨髓单个核细胞中CD74 mRNA和P65 mRNA的表达水平进行比较,进而探讨CD74及P65在急性白血病发生发展中的可能作用。材料与方法1.1研究对象：郑州大学第一附属医院血液内科2010年3月到2010年7月住院的急性白血病患者49例,根据骨髓细胞形态学,和白血病免疫分型及细胞遗传学诊断,均符合急性白血病的诊断标准。49例急性白血病（初治/复发难治）,其中19例急性淋巴细胞白血病（B-ALL12例,T-ALL7例）,30例急性髓细胞白血病（M215例,M34例,M43例,M58例）。男18例,女31例,中位年龄36岁（14岁～64岁）。缓解组和对照组：24例完全缓解患者（ALL 8例,AML 16例）。男18例,女6例,中位年龄39岁（17岁～68岁）。对照组为12例为非恶性血液病患者,男6例,女6例,中位年龄25岁（18岁～81岁）。所有患者均为我院血液内科住院患者,符合WHO（2000）分型诊断标准。1.2实验方法（RT-PCR）:采集患者骨髓2～4ml,应用淋巴细胞分离液提取骨髓单个核细胞,调整细胞浓度为1×107个/ml。TRIZOL法提取细胞总RNA,然后根据cDNA试剂盒描述的方法,配制逆转录反应体系共20μl。将合成的cDNA产物在CD74和P65特异性引物的存在下进行PCR扩增。PCR反应的总体系为：Taq Master MIX 2×, Forward primer （1OμM）, Reverse primer （10μM）, Template, RNase-Free water共50μl体系。经过25个循环后,取PCR产物3μl在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳,以5μl的Sunbio DNA MarkerⅠ作为分子量的电泳标记。电泳后在紫外线灯下观察结果并照相,扫描电泳条带的灰度值,所得的结果进行分析。1.3统计学处理：应用SPSS16.0统计软件进行分析,计数资料采用χ2检验,计量资料用均数±标准差（x±s）来表示,CD74 mRNA和P65 mRNA相关分析采用spearman级联相关分析,检验水准设为α=0.05,P<0.05有统计学意义。结果1.CD74 mRNA在急性白血病BMMNC（Bone Marrow Mononuclear Cell）的表达CD74在急性白血病骨髓单个核细胞表达的阳性率为81.6%,其中在急性髓细胞白血病的阳性率为80%,在急性淋巴细胞白血病阳性率为84.2%；两组间无统计学意义（P>0.05）,但是均显著高于对照组的阳性率16.7%（P<0.05）。在19例急性淋巴细胞白血病中,CD74 mRNA在B-ALL的阳性率（n=12,100%）高于T-ALL的阳性率（n=4,为57.1%）（P<0.05）。2. P65 mRNA在急性白血病BMMNC的表达P65在急性白血病骨髓单个核细胞表达的阳性率为59.2%,其中在急性髓细胞白血病的阳性率为53%,在急性淋巴细胞白血病阳性为68.4%；两组间无统计学意义（P>0.05）,但均显著高于对照组的阳性率为8.3%（P<0.05）。比较B-ALL（n=10,83.3%）与T-ALL（n=3,42.9%）的阳性率,两组间的差别无统计学意义（P=0.067>0.05）。3.CD74 mRNA和P65 mRNA在急性白血病中的共表达及相关性CD74及P65在急性白血病的共同表达阳性率为48.9%,两者呈正相关（P<0.05）,CD74及P65在ALL的共同表达阳性率为83.3%,两者呈正相关（P<0.05）。CD74及P65在AML的共同表达阳性率为46.7%,两者呈正相关（P<0.05）。4.CD74 mRNA和P65 mRNA的表达与临床特征的关系CD74及P65的表达水平与患者性别、年龄、骨髓原始细胞数及髓外侵润,外周血白细胞计数等临床特征无相关性（P>0.05）。5.白血病完全缓解后CD74 mRNA和P65 mRNA的表达完全缓解组24例,AML16例,ALL8例。在16例AML中,10例在缓解后2月内,CD74和P65的表达呈弱阳性：6例于缓解3月后,检测CD74和P65,呈阴性表达。在8例ALL中,4例于化疗后6月内检测CD74和P65的表达,其为弱阳性；而4例于缓解后6-10月间检测CD74和P65的表达,均为阴性。6. CD74 mRNA和P65 mRNA表达水平与预后的关系以mRNA表达的灰度值的中位数0.8为界,将患者分为高表达组和低表达组,分析其预后。本文49例急性白血病,17例高表达CD74者,9例复发；23例低表达CD74者,3例复发；9例不表达CD74者,无复发；8例高表达P65者,5例复发；21例低表达P65者,5例复发；20例不表达P65者,2例复发。高表达CD74或P65者例复发率高（P<0.05）,而复发率的差别低表达与不表达CD74或P65者之间无统计学意义（P>0.05）。结论1.CD74及P65在急性白血病患者骨髓单个核细胞异常高表达且呈正相关,急性白血病缓解后其表达下降。2.CD74及P65在急性髓系白血病和急性淋巴细胞白血病中的表达差别无统计学意义,而B-ALL的表达CD74阳性率显著高于T-ALL的表达。3.CD74及P65高表达水平者预后不良。
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