论文摘要
乳腺癌最容易远处转移到骨,其骨转移的机理迄今为止仍未完全阐明,这也使得针对骨转移的各种治疗方法效果均不够满意。因此进一步阐明乳腺癌骨转移的分子机制,对乳腺癌骨转移的预防和治疗具有重要意义。虽然已知骨组织中的骨保护素（osteoprotegerin,OPG）表达下降是乳腺癌骨转移发生发展的关键因素和肿瘤细胞自身OPG表达可能促进肿瘤生长和转移,且重组人OPG已进入治疗乳腺癌骨转移的临床实验,但肿瘤细胞自身OPG表达在乳腺癌骨转移发生发展中的作用和机制目前仍不清楚,这也制约了针对OPG的乳腺癌骨转移治疗方法的发展。为此,我们以乳腺癌细胞株MDA-MB-231和裸鼠骨转移动物模型为研究对象,试图探讨肿瘤细胞自身OPG表达在乳腺癌骨转移发生发展中的作用和机制。本研究分为以下几个部分:1.乳腺癌骨转移动物模型的构建目的建立乳腺癌骨转移动物模型。方法40只4周～6周龄雌性裸鼠随机分为5组,每组8只,用浓度分别为1×105/ml,1×106/ml,5×106/ml,1×107/ml,5×107/ml的MDA-MB-231细胞悬液0.1ml行左心室注射。观察裸鼠左心室注射致死情况及存活裸鼠49天后骨转移发生情况。结果左心室穿刺注射总致死率为32.50%（13/40）;各组左心室穿刺注射致死率分别为1/8,1/8,1/8,3/8,7/8,组间比较差异有统计学意义（P=0.004）。全组骨转移发生率为48.15%（13/27）;各组骨转移发生率分别为:0/7,3/7,5/7,4/5,1/1,各组骨转移发生情况差异有统计学意义（P=0.014）。结论经裸鼠左心室穿刺注射肿瘤细胞成功建立了乳腺癌骨转移动物模型;经裸鼠左心室注射建立乳腺癌骨转移动物模型的肿瘤细胞适宜浓度为5×106/ml。2.建立乳腺癌骨转移动物模型方法的比较研究目的对四种乳腺癌骨转移动物模型的构建方法进行比较研究。方法32只4～6周龄雌性裸鼠随机分为A、B、C、D 4组,每组8只,每只裸鼠以5×105个MDA-MB-231细胞按分组分别注射入左第二乳房脂肪垫、尾静脉、左心室和左胫骨骨髓腔。观察A组裸鼠乳腺原位成瘤情况、全组注射致死情况和全组49天后骨转移发生情况。结果A组乳腺原位移植瘤形成率为87.5% （7/8）。仅C组注射致死裸鼠1只。各组骨转移发生率分别为:0 （0/8）, 12.5% （1/8）,71.4% （5/7）,100% （8/8）。A组和C组、A组和D组、B组和C组、B组和D组之间骨转移发生率差异均有统计学意义。结论肿瘤细胞经乳腺原位移植和尾静脉注射移植两种方法不适于建立乳腺癌骨转移模型;肿瘤细胞经左心室注射移植和骨原位移植方法能稳定地获得骨转移,是乳腺癌骨转移动物模型构建的可行方法。3. RNA干扰对MDA-MB-231乳腺癌细胞株骨保护素基因表达的抑制作用目的构建针对骨保护素（osteoprotegerin,OPG）基因的一个载体编码三条shRNA的真核表达质粒,观察其对MDA-MB-231乳腺癌细胞株OPG表达的抑制作用。方法选择3个针对OPG基因的RNAi位点,分别设计合成3对编码相应shRNA的DNA单链,每对单链连接形成双链后分别与线性化载体pGenesil-1.1、pGenesil-1.2、pGenesil-1.3连接形成pGenesil-1.1-shRNA1、pGenesil-1.2-shRNA2、pGenesil-1.3- shRNA2,对以上重组载体反复酶切连接,构建成重组质粒pGenesil-1.1-1.2-1.3-shRNA1- shRNA2-shRNA3,酶切鉴定和测序无误后,将该质粒转染MDA-MB-231细胞,以G418加压筛选,对转染细胞行单克隆化,稳定转染细胞行RT-PCR和Western blot检测,确定其对OPG基因表达抑制作用。结果成功构建了pGenesil-1.1-1.2-1.3-shRNA1- shRNA2-shRNA3重组质粒;以该质粒稳定转染MDA-MB-231细胞后其OPG mRNA和蛋白表达均较对照差异具有统计学意义,RNAi对OPG mRNA和蛋白的表达抑制率分别为91%和73%。结论本研究构建了针对OPG的一个载体编码三条shRNA的真核表达质粒,通过RNAi抑制了MDA-MB-231细胞OPG基因表达,为进一步深入探讨肿瘤细胞自身OPG表达在乳腺癌骨转移发生发展中的作用提供相关实验基础。4.抑制骨保护素表达对乳腺癌细胞增殖及TRAIL致其凋亡的影响目的观察抑制肿瘤细胞OPG表达对乳腺癌细胞株MDA-MB-231增殖和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor related apoptosis inducing ligand,TRAIL）致其凋亡的影响。方法采用MTT法检测对照MDA-MB-231和MDA-MB-231i细胞（OPG表达抑制）增殖;流式细胞术分析对照MDA-MB-231细胞和TRAIL作用24h后MDA-MB-231、MDA-MB-231i细胞凋亡率。结果前两组细胞倍增时间分别为43.5±2.9和45.8±3.6小时,差异无统计学意义;后三组细胞凋亡率分别为6.4±1.3%、16.1±1.7%和24.4±3.3%,每两组之间差异均有统计学意义。结论抑制乳腺癌细胞OPG表达不影响其增殖能力。TRAIL可以诱导乳腺癌细胞凋亡,抑制乳腺癌细胞OPG表达显著增强TRAIL诱导其凋亡能力。5.抑制肿瘤细胞骨保护素表达对乳腺癌细胞致骨转移能力的影响目的观察抑制肿瘤细胞骨保护素表达对乳腺癌细胞株MDA-MB-231致骨转移的影响。方法32只4～6周龄雌性裸鼠随机分为A、B、C、D 4组,每组8只,A、C组每只裸鼠按分组分别以5×105个MDA-MB-231细胞注射入左心室和左胫骨骨髓腔。B、D组每只裸鼠按分组分别以5×105个MDA-MB-231i细胞（OPG表达抑制）注射入左心室和左胫骨骨髓腔,42天后行病理检查,比较A、B组骨转移发生率和骨转移灶数量,比较C、D组骨肿瘤体积。结果A组骨转移灶数量多于B组,两组差异具有统计学意义。A组骨转移发生率虽高于B组,但两者差异无统计学意义。C组骨肿瘤体积大于D组,两组差异具有统计学意义。结论乳腺癌细胞致骨转移能力与其OPG表达水平密切相关,抑制OPG表达可以降低乳腺癌细胞致骨转移能力。低表达OPG的乳腺癌细胞骨转移能力下降的原因为:抑制乳腺癌细胞OPG表达使得癌细胞自身表达的OPG对其保护作用减弱,骨组织表达的TRAIL对其诱导凋亡作用增强,促使癌细胞凋亡,抑制骨转移形成。通过以上研究,进一步阐明了肿瘤细胞自身OPG表达在乳腺癌骨转移发生发展中的作用和机制,为将来各种针对OPG的乳腺癌骨转移治疗方法（如AMGN-0007等）的临床应用提供了更充分的实验基础。