南极中山站生活污水及石油污染区域细菌多样性分析

论文摘要

随着南极研究的深入进行,人类的科学考察活动对南极环境造成的影响越来越引起重视。本文针对南极中山站周围生活污水、石油污染两大问题进行分析,采集了2005、2006两个年份的相关区域的环境样品,研究了样品中微生物多样性、群落结构,及其逐年的变化;建立了石油污染降解相关的xylE基因的定量PCR检测技术。为我国在南极活动中的环境评估,科考活动方案制订,以及参与国际南极活动提供科学依据。以南极中山站排污口及其右侧50米处土壤为研究对象,经土样采集、DNA提取、纯化后,使用341f+534r通用引物进行扩增,得到包含V3可变区的16SrDNA片段。经变性梯度凝胶电泳（DGGE）及测序分析发现,相较于右侧50米处,排污口土壤样品中细菌组成结构上并未发生较大变化,但由于受到污水浸泡影响,两处土壤上下层的生物量分布上出现了差异,受到污染的排污口土壤不同于其右侧50米处土壤的上层明显远远高于下层的分布情况,上下层生物量几乎一致。而原核藻类Chlorella sp.的富集以及外源性的肠道传染性微生物Trichococcus pasteurii、Dolosigranulum pigrum的检出进一步说明了排污口土壤样品受污染的情况。尽管污水的排放并没有对排污口土壤中的微生物生态造成极为严重的破坏,但其造成的影响已经非常明显。另一项关于污水排放的研究以2005、2006两年排污口上下层土壤样品,加上对照样品2006排污口左侧100m处土壤为研究对象,通过对其分别构建环境样品的微生物16S rDNA克隆文库,采用PCR-RFLP分析、16S rDNA序列测定以及系统发育分析的方法,调查研究了污水排放对土壤微生物生态的影响以及持续排放所引发的土壤微生物多样性的的变化。结果表明两年排污口土壤具有完全不同于作为对照的排污口左侧100m处土壤的细菌多样性及细菌组成结构。调查发现污水排放造成的影响有:i.两年排污口土壤样品细菌多样性远大于排污口左侧100m处,而2006年排污口下层土壤样品又明显高于2005年的排污口下层;ii.两年排污口下层土壤中均发生了明显的肠道细菌富集的现象;iii.两年排污口土壤中均发现一定数量的外来细菌,他们除具有特殊有机物的降解能力,且在环境中已经形成了一定的数量。关于南极中山站石油污染状况的研究是通过广泛考察南极中山站可能受石油污染的各站位,以分析土壤中石油降解型微生物生态结构的方式,来估计因石油实用而造成的影响。在分析了石油污染物的主要成分后,针对可降解C6-C12烷烃的alkB基因和降解甲苯和二甲苯的xylE基因,分别设计引物alkB F&R和xylE F&R对各站位以PCR的方法对各站位土壤进行检测。扩增结果显示,垃圾焚烧处b下层（10-20cm）土壤中检测出了alkB基因,而在垃圾焚烧处a和b的上层（0-10cm）和下层土壤中,均发现了xylE基因的存在。在对污染范围的调查中发现,xylE F&R可以分别在距离垃圾焚烧处b不同距离（0-10m）的上下层土壤中有效检测出xylE基因,而alkB却不能有效扩增。进一步以RFLP对xylE基因的扩增片断进行分析发现,虽然检测出的xylE来源丰富,但克隆主体集中于5个基因型,超过2/3的多数来源于Pseudomonas sp. ST41和Pseudomonas stutzeri。实验结果表明,在对南极土壤的石油污染影响调查中,对于xylE基因的检测比alkB更能准确反映环境受污染的状况;而南极中山站各站位检测结果表明,垃圾焚烧处a和b均受到了较为严重的石油污染,污染范围约为10m,深度超过20cm;垃圾焚烧处a、b均为造成该处石油污染的中心地区,两处土壤中的xylE基因拷贝数已经达到了106个/克土壤。通过上述三项实验,我们对人为活动引发的污染污水排放及石油使用所造成的影响,尤其是对土壤微生物生态上的影响有了比较深入的认识。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 南极生态学研究简介
• 1.1.1 南极概况
• 1.1.2 中山站简介
• 1.1.3 人类科考活动造成的影响
• 1.2 中山站污染分析
• 1.2.1 排污口生活污水排放
• 1.2.2 石油及其衍生物污染
• 1.3 生物技术在分子微生物生态学上的应用
• 1.3.1 用于分子微生物生态学的主要方法
• 1.3.2 分子生态学的常用技术
• 1.3.3 生物技术在种群结构鉴定中的应用
• 1.4 极端微生物的研究在南极环境保护上的意义
• 1.4.1 低温微生物基础研究概述
• 1.4.2 低温微生物在生物修复中的应用
• 1.5 本论文的思路、目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.2 基本方法
• 3 结果与分析
• 3.1 南极中山站土壤总DNA 的提取
• 3.1.1 不同样品总DNA 提取结果
• 3.1.2 DNA 提取效率检测
• 3.1.3 粗提DNA 的纯化
• 3.2 南极中山站排污口土壤细菌群落结构调查
• 3.2.1 基因组DNA 序列的PCR 扩增
• 3.2.2 16S rDNA PCR 扩增片断的DGGE 分析
• 3.2.3 序列分析
• 3.2.4 16S rDNA 序列扩增
• 3.2.5 16S rDNA 序列RFLP 分析
• 3.2.6 细菌16S rDNA 克隆文库的构建
• 3.3 南极中山站石油污染调查
• 3.3.1 石油污染物降解基因检测分析
• 3.3.2 石油污染范围探查
• 3.3.3 alkB & xylE 基因克隆文库的构建
• 3.3.4 alkB & xylE 的RFLP 分析
• 3.3.5 南极中山站土壤石油污染生物降解细菌组成分析
• 3.3.6 xylE 基因土壤含量定量检测
• 4 讨论
• 4.1 南极土壤中总DNA 的提取
• 4.2 利用变性梯度凝胶电泳（DGGE）进行微生物多样性研究方面的几点认识
• 4.3 南极中山站土壤细菌多样性分析及污染调查
• 4.3.1 南极中山站排污口 2005 年样品微生物群落结构 DGGE 法分析
• 4.3.2 南极中山站排污口 2005&2006 年样品微生物群落结构 RFLP 法分析
• 4.3.3 南极中山站石油污染综合调查
• 5 总结
• 参考文献
• 致谢
• 附录一 采样位点图示