鸭瘟强、弱毒株在感染鸭体内的动态分布及免疫应答

论文摘要

鸭瘟（Duck plague,DP）是由疱疹病毒科中的鸭瘟病毒（Duck plague virus,DPV）引起的常见于鸭、鹅、天鹅等水禽的一种高度致死性传染病。该病在世界各养鸭地区都有分布,其预防和控制对于水禽养殖业的发展具有重要意义。临床和实验室证实DPV弱毒疫苗是预防和控制该病的有效生物制剂,往往在免疫鸭后几小时就对机体产生一定程度保护力。现有关于DPV弱毒疫苗免疫发生机理的研究资料主要集中于系统免疫与免疫保护力的关系,忽略了特异性黏膜免疫在抵抗DPV强毒感染中的作用,难以全面揭示DPV弱毒疫苗免疫保护机理。而黏膜免疫系统（Mucosal immunesystem,MIS）是除了经典的细胞免疫与体液免疫外,存在于机体的另一种高度完整和调节完善的免疫系统。目前禽类MIS的研究较为缓慢,且大部分集中于鸡的黏膜免疫研究。为了全面系统了解鸭体内MIS的诱导机制,本研究将DPV弱毒疫苗经皮下注射、口服和滴鼻三种途径免疫20日龄鸭并在各组设立同居未免疫鸭后,对疫苗抗原在机体内的分布和增殖规律、免疫鸭呼吸道和消化道等局部黏膜的细胞和体液免疫发生规律进行了系统的研究:同时为了解机体MIS对强毒感染的应答机制,本研究还对不同途径感染DPV强毒鸭进行了以上各方面研究。本研究同时应用ERIC-PCR技术对不同途径免疫DPV弱毒鸭肠道菌群结构的多样性和动态变化进行了研究和分析,获得以下系列结果:1.应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR方法对DPV强、弱毒在感染鸭体内的定量检测分析表明:不同途径免疫DPV弱毒疫苗均可在免疫后第12小时分布于鸭呼吸道、消化道和各免疫器官中并快速增殖,而DPV分布到各组织器官的顺序与免疫途径有密切关系:强毒力和弱毒力的DPV均对鸭免疫器官和肠道具有较强噬性。免疫鸭体内DPV弱毒含量于免疫后第24小时达到最高值后缓慢下降,提示DPV弱毒苗诱导的机体系统免疫和黏膜免疫抑制了鸭体内病毒的增殖。至免疫后第60天依然可在大部分免疫器官中检出低拷贝数DNA的DPV弱毒对持续诱导鸭免疫系统长时间产生特异性免疫力具有重要意义。各组同居未免疫鸭体内均可检出DPV弱毒,表明人工免疫鸭排出的DPV弱毒可感染同居鸭,这对加强机体免疫、诱导以非黏膜免疫途径（皮下免疫）免疫鸭产生黏膜免疫反应具有重要意义。不同途径感染DPV强毒鸭体内病毒含量迅速增加直至感染鸭死亡或耐过。2.应用间接ELISA方法对实验鸭血液、胆汁、呼吸道和消化道分泌液中的DPV特异性SIgA、IgG和IgM抗体消长规律进行检测的结果表明:SIgA是DPV弱毒苗诱导鸭MIS中抗病原微生物感染的主要体液免疫因子,IgM在所有受检体液中检出时间最早,IgG是系统免疫的主要体液免疫因子。不同途径免疫鸭除可在局部黏膜分泌液产生高滴度的特异性SIgA、IgM和IgG抗体外,还可在黏膜远端产生特异性抗体,表明不同途径免疫DPV弱毒苗可同时诱导鸭MIS和共同黏膜免疫系统（Common mucosalimmune system,CMIS）;而DPV弱毒最早到达的黏膜位点处的特异性抗体检出时间最早、抗体滴度最高。免疫后第60天依然可在弱毒免疫鸭大部分受检样品中检出不同滴度水平的特异性抗体,其中尤以肠道分泌液中的特异性SIgA和血液中的IgG抗体水平最高。不同途径感染DPV强毒鸭体内未检出或只检出较低滴度特异性抗体,表明包括消化道和呼吸道黏膜在内的鸭各组织样品的病理损伤直接影响机体特异性抗体的生成。3.应用间接免疫过氧化物酶组织化学染色法对实验鸭消化道、呼吸道和主要免疫器官组织石蜡切片中IgA+细胞变化规律进行检测的结果显示:所有弱毒免疫鸭及其同居未免疫鸭各受检组织器官中IgA+细胞数量与对照鸭相比均有不同程度的增加,且最早检出DPV弱毒苗的组织局部黏膜中IgA+细胞数量最多。提示不同途径免疫DPV弱毒苗均可诱导鸭体内IgA+细胞增殖,而免疫途径的选择对诱导鸭局部黏膜效应位点中IgA+细胞的增殖至关重要。免疫鸭肠道黏膜固有层中IgA+细胞数量为所有检测组织部位中最多,其中尤以十二指肠黏膜固有层中最为明显,表明鸭肠道黏膜固有层是鸭MIS最主要的效应位点。所有免疫鸭及其同居鸭体内IgA+细胞数量增殖的动态变化与SIgA抗体滴度的变化规律相符,表明免疫鸭局部黏膜效应位点中IgA+细胞的增殖规律与特异性SIgA抗体滴度密切联系。不同途径感染DPV强毒鸭体内IgA+胞数量随着机体各黏膜组织部位病理损伤程度的加剧而迅速减少或出现轻微增加后再急剧减少。表面鸭体各组织器官,尤其是各黏膜组织部位的病理损伤直接影响IgA+细胞的生成及增殖。4.应用双抗原顺序间接免疫过氧化物酶法对实验鸭消化道、呼吸道和主要免疫器官组织石蜡切片中DPV+和CD3+细胞变化规律进行检测的结果显示:DPV+最早可于接种后第1-3天在弱毒免疫鸭或强毒感染鸭体内检出,且不同毒力DPV均对各组织器官的上皮细胞和淋巴细胞具有较强噬性。所有弱毒免疫鸭及其同居未免疫鸭各受检器官中CD3+细胞数量均于免疫后第3-6天较对照鸭开始增加并于第15-21天达到数量峰值,其中口服免疫鸭体内CD3+细胞数量开始增加的时间最早,细胞数量最多。表明不同途径免疫DPV弱毒均可诱导鸭体内CD3+细胞增殖,而局部黏膜中DPV弱毒最早检出的时间和增殖的速度决定该处黏膜免疫诱导位点和效应位点中CD3+细胞的水平。CD3+细胞主要聚居于肠道尤其是十二指肠黏膜固有层中,在气管黏膜固有层及免疫器官淋巴小节等部位也可见较多CD3+细胞。表明鸭局部黏膜固有层是机体MIS最大的效应位点;而肠道在诱导鸭黏膜免疫反应中具有重要作用。不同途径感染DPV强毒鸭体内各组织器官中CD3+细胞数量则随着机体各黏膜组织部位病理损伤程度的加剧而急剧减少或略微增加后再剧烈减少。5.应用ERIC-PCR方法对DPV弱毒免疫鸭各肠段中菌群结构多样性和动态变化进行检测的结果表明:健康正常鸭十二指肠、空肠和回肠中菌群结构较盲肠和直肠能够更早形成平衡稳定的微生态体系,而不同途径免疫DPV弱毒疫苗均对鸭肠道中菌群结构产生不同程度的影响。不同途径免疫鸭十二指肠中菌群结构较其它肠段可更快与肠黏膜表面的DPV抗原和SIgA形成新的、平衡稳定的共存关系。免疫鸭肠道内菌群ERIC-PCR扩增优势条带比对结果均为动物肠道内的正常菌,其中大肠杆菌、欧文氏菌、芽孢杆菌等需氧或兼性厌氧菌广泛分布于鸭体整个肠道组织中;乳酸杆菌、肠球菌等厌氧或兼性厌氧菌主要分布于肠道后段,特别是盲肠内。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩写
• 第一部分 文献综述
• 第一章 鸭瘟免疫学研究进展
• 1 DPV的免疫原性
• 2 DPV对免疫器官的噬性
• 3 免疫病理
• 4 鸭瘟弱毒苗免疫效力研究
• 5 免疫途径的研究
• 6 鸭瘟的预防
• 第二章 黏膜免疫学与禽类疫病防治研究进展
• 1 黏膜免疫系统概述
• 1.1 黏膜免疫系统组成
• 1.2 黏膜免疫系统特点
• 1.3 黏膜免疫系统的功能
• 1.4 黏膜免疫反应的基本过程
• 1.5 黏膜诱导的耐受
• 2 黏膜疫苗的研制
• 3 黏膜免疫的主要途径
• 3.1 消化道免疫可以产生良好的黏膜免疫应答
• 3.2 呼吸道是黏膜免疫中诱导黏膜免疫应答的有效部位
• 3.3 黏膜免疫的另一途径是泌尿生殖道黏膜
• 3.4 分泌腺也是一种重要的黏膜免疫途径
• 4 黏膜免疫与禽累疫病防治
• 5 黏膜免疫的研究动态
• 第二部分 实验研究
• 第三章 基于TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR对DPV强、弱毒在家鸭体内侵染、增殖和排泄规律的研究
• 1 材料
• 1.1 种毒、实验鸭及试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 实验动物分组和处理
• 2.2 样品采集部位和处理方法
• 2.3 模板DNA的抽提
• 2.4 TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR检测DPV-DNA
• 2.5 实验结果的数据分析
• 3 结果
• 3.1 临床症状和病理变化
• 3.2 DPV弱毒免疫鸭体内抗原分布与增殖规律
• 3.3 DPV在同居未免疫鸭体内分布与增殖规律的检测结果
• 3.4 DPV Chv强毒株在感染鸭体内分布与增殖规律的检测结果
• 4 讨论
• 4.1 基于Taq-Man MGB探针荧光实时定量PCR对DPV在机体内增殖分布规律研究的优越性
• 4.2 关于DPV强、弱毒在鸭免疫器官中的动态分布和增殖规律
• 4.3 关于DPV弱毒在免疫鸭消化道和呼吸道内的动态分布和增殖规律
• 4.4 关于DPV弱毒免疫鸭排毒与同居鸭感染DPV弱毒之间的关系
• 5 小结
• 第四章 不同途径接种DPV强、弱毒诱导鸭抗体介导的黏膜免疫与系统免疫发生规律的研究
• 1 材料
• 1.1 病毒、试验动物和主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 试验动物分组及处理
• 2.2 被检样本采集
• 2.3 实验鸭局部黏膜分泌液、胆汁和外周血中抗DPV特异性SIgA、IgG和IgM变化规律的研究
• 3 结果与分析
• 3.1 不同途径免疫DPV弱毒鸭及其同居鸭在不同时间的血清、胆汁、气管和消化道中抗DPV特异性SIgA、IgM和IgG滴度及其分布特点
• 3.2 不同途径感染DPV强毒鸭在不同时间的血清、胆汁、气管和消化道中抗DPV特异性SIgA、IgM和IgG抗体滴度及其分布特点
• 3.3 对照组
• 4 讨论
• 4.1 DPV弱毒苗经不同免疫途径诱导鸭局部黏膜和系统免疫中SIgA、IgM和IgG发生规律
• 4.2 关于免疫鸭与同居鸭体内IgG、IgM和SIgA的消长规律之间的关系
• 4.3 关于胆汁中抗DPV特异性SIgA、IgG和IgM的检测
• 5 小结
• +细胞水平变化的研究'>第五章 不同途径接种DPV强、弱毒诱导鸭局部黏膜及免疫器官中IgA⁺细胞水平变化的研究
• 1 材料
• 1.1 病毒、试验动物和主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 试验动物分组及处理
• 2.2 样品的采集及处理
• 2.3 组织包埋及切片
• +细胞方法的染色程序'>2.4 间接免疫过氧化物酶法检测IgA⁺细胞方法的染色程序
• +细胞检测判定标准'>2.5 IgA⁺细胞检测判定标准
• +细胞在鸭瘟弱毒免疫鸭和同居未免疫鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律'>2.6 间接免疫组织化学检测IgA⁺细胞在鸭瘟弱毒免疫鸭和同居未免疫鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律
• +细胞的检测'>2.7 正常对照鸭局部黏膜组织和免疫器官中IgA⁺细胞的检测
• 3 结果与分析
• +细胞在DPV弱毒免疫鸭和同居未免疫鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律'>3.1 间接免疫组织化学法检测IgA⁺细胞在DPV弱毒免疫鸭和同居未免疫鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律
• +细胞在DPV强毒感染鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律'>3.2 间接免疫组织化学检测IgA⁺细胞在DPV强毒感染鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律
• +细胞在正常对照鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律'>3.3 间接免疫组织化学检测IgA⁺细胞在正常对照鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律
• 4 讨论
• +细胞在消化道和呼吸道黏膜组织中的发生增殖规律及其黏膜免疫学意义'>4.1 IgA⁺细胞在消化道和呼吸道黏膜组织中的发生增殖规律及其黏膜免疫学意义
• +细胞在免疫器官中的发生规律及其免疫学意义'>4.2 IgA⁺细胞在免疫器官中的发生规律及其免疫学意义
• 5 小结
• +细胞动分布关系的研究'>第六章 不同途径接种DPV强、弱毒诱导鸭局部黏膜及免疫器中DPV和CD3⁺细胞动分布关系的研究
• 1 材料
• 1.1 病毒、试验动物和主要试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要溶液的配制
• 2 方法
• 2.1 试验动物分组及处理
• 2.2 样品的采集及处理
• 2.3 组织包埋及切片
• +细胞和DPV⁺方法的染色程序'>2.4 间接免疫过氧化物酶法顺序检测CD3⁺细胞和DPV⁺方法的染色程序
• +细胞和DPV检测的判定标准'>2.5 CD3⁺细胞和DPV检测的判定标准
• +细胞和DPV⁺在弱毒免疫鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律的研究'>2.6 双抗原间接免疫组织化学检测CD3⁺细胞和DPV⁺在弱毒免疫鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律的研究
• +细胞和DPV⁺的检测'>2.7 正常对照鸭局部黏膜组织和免疫器官中CD3⁺细胞和DPV⁺的检测
• 3 结果与分析
• +细胞和DPV⁺在DPV弱毒免疫鸭和同居未免疫鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律'>3.1 双抗原间接免疫组织化学方法检测CD3⁺细胞和DPV⁺在DPV弱毒免疫鸭和同居未免疫鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律
• +和CD3⁺细胞在DPV强毒感染鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律'>3.2 间接免疫组织化学法检测DPV⁺和CD3⁺细胞在DPV强毒感染鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律
• +和CD3⁺细胞在正常对照鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律'>3.3 间接免疫组织化学法检测DPV⁺和CD3⁺细胞在正常对照鸭局部黏膜组织和免疫器官中动态分布和增殖规律
• 4 讨论
• +细胞在鸭局部黏膜组织中的动态分布和增殖规律及其黏膜免疫学意义'>4.1 DPV和CD3⁺细胞在鸭局部黏膜组织中的动态分布和增殖规律及其黏膜免疫学意义
• +细胞在鸭免疫器官中的动态分布和增殖规律及其黏膜免疫学意义'>4.2 DPV和CD3⁺细胞在鸭免疫器官中的动态分布和增殖规律及其黏膜免疫学意义
• 5 小结
• 第七章 不同途径免疫DPV弱毒鸭肠道菌群结构变化特征的初步分子解析
• 1 材料
• 1.1 病毒、实验动物及试剂
• 1.2 主要仪器
• 1.3 主要试剂的配制
• 2 方法
• 2.1 实验动物分组和处理
• 2.2 样品采集及处理
• 2.3 细菌模板总DNA的抽提
• 2.4 引物合成
• 2.5 ERIC-PCR的反应体系和反应条件
• 2.6 各肠道菌群总DNA的ERIC-PCR扩增
• 2.7 ERIC-PCR产物主带的克隆及测序
• 3 结果与分析
• 3.1 正常对照鸭各肠段的菌群结构特征
• 3.2 不同途径免疫DPV弱毒鸭各肠段菌群结构的变化规律
• 3.3 ERIC-PCR产物的克隆测序结果与Genbank中已登录细菌DNA序列的比对分析
• 4 讨论
• 4.1 关于健康对照鸭肠道内正常菌群结构动态分布的分析
• 4.2 关于免疫鸭肠道中菌群结构的变化规律
• 4.3 关于对照鸭和免疫鸭肠道菌的分析
• 5 小结
• 第三部分 结论
• 参考文献
• 文章附图和附表
• 致谢
• 作者简介