农杆菌介导NPR1基因对百合遗传转化的研究

论文摘要

百合（Lilium spp.）不但花姿独特,同时还具备药用和食用价值,深受国内外市场的喜爱。随着百合栽培面积的不断扩大,这种易感病的植物常常引起大面积的病害,造成巨大的经济损失。然而传统的药剂防治不但增加人工成本,还会对环境造成污染,应用抗病品种是病害防治的最直接有效的方法。但采用传统的育种方法不但周期较长,受亲本影响较大,因此这种育种方法不能满足生产的需要。随着植物生物技术的不断发展,直接将外源目的基因导入植物材料中,这为百合培育新品种开辟了新的道路。本研究以抗病能力差的东方百合“Sorbonne”为试材,对东方百合鳞片进行了直接再生不定芽系统的建立,同时以鳞片为外植体进行了愈伤组织的诱导,进行了愈伤组织经体细胞胚发生途径再生的研究。并对直接再生过程中的生根情况进行了比较,对鳞片愈伤的诱导体胚发育进行了较为深入的研究。在此基础上以百合鳞片为遗传转化受体,以鳞片直接再生芽方式为再生途径,将植物广谱抗病基因（NPR1基因）通过农杆菌介导转化百合,建立了稳定的遗传转化体系,得到了经PCR检测为阳性的植株。本研究的主要结果如下:1.百合鳞片直接再生不定芽体系:以百合鳞片为外植体,最佳芽诱导培养基为MS+6-BA0.4mg/L+NAA1.0mg/L,芽诱导率达到96.7%;最佳生根培养基为MS+IBA0.5mg/L,生根率为95.2%。2.百合愈伤组织体细胞胚发生途径的再生体系:以百合鳞片作为外植体,最佳愈伤诱导培养基为MS+2,4-D 2.0mg/L +6-BA 0.5mg/L+水解酪蛋白300mg/L,诱导率为68.3%;最佳胚性愈伤诱导培养基为MS+2,4-D2.0mg/L +6-BA0.5mg/L+水解酪蛋白150mg/L+谷氨酰胺150mg/L,诱导率为75.0%;将其放入MS+2,4-D 0.5 mg/L +KT 0.3 mg/L+蔗糖40g/L中培养,体胚形成率为60.0%,最佳体细胞胚萌发培养基为MS+6-BA0.5 mg/L。通过石蜡切片法对鳞片愈伤的发育过程观察发现,首先外植体表层细胞形成愈伤组织,随后在愈伤组织表面形成许多瘤状凸起,这些凸起继续发育成球形胚、心形胚,最后发育成熟形成完整植株。3.百合遗传转化体系:以百合鳞片为转化受体,在用农杆菌侵染前预培养2天,侵染时菌液浓度为OD600=0.5,侵染时间为20min,20℃下共培养时间2天,共培养之后进行Km浓度为30―80―130mg/L的依次筛选,头孢霉素在除菌过程中使用浓度为400mg/L,直至抗性芽的形成。通过实验发现在共培养时,去除培养基中NH4NO3,并向其中加入100mg/L的乙酰丁香酮可提高转化率。4.抗性植株的PCR检测:由直接芽再生途径得到的56株抗性植株中有3株呈阳性,阳性率为5.4%,占该再生系统总转化外植体900块的0.33%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 引言
• 1.1 研究的目的和意义
• 1.2 研究进展
• 1.2.1 植物抗病基因工程的方法
• 1.2.2 NPR1 基因的研究进展
• 1.2.3 百合基因工程研究进展
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株
• 2.1.3 分子生物学及生化试剂
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 组织培养条件
• 2.1.6 PCR 检测材料
• 2.2 方法
• 2.2.1 百合高频再生体系的建立
• 2.2.2 质粒转化农杆菌
• 2.2.3 百合遗传转化体系的建立
• 3 结果与分析
• 3.1 百合直接器官发生途径再生体系的建立
• 3.1.1 百合鳞片芽分化诱导培养基的优化
• 3.1.2 试管苗的生根比较
• 3.2 百合愈伤组织经体细胞胚发生途径再生体系的建立
• 3.2.1 胚性愈伤组织的诱导
• 3.2.2 体细胞胚的形成
• 3.2.3 体细胞胚的萌发
• 3.2.4 驯化与移栽
• 3.3 百合体细胞胚形成过程的组织学观察
• 3.4 质粒转化农杆菌
• 3.4.1 大肠杆菌质粒的提取
• 3.4.2 质粒转化农杆菌
• 3.5 百合遗传转化体系的建立
• 3.5.1 抗生素选择压力的确定
• 3.5.2 抗生素抑菌浓度的确定
• 3.5.3 影响遗传转化的主要因素
• 3.6 转化植株的PCR 检测
• 4 讨论
• 4.1 百合愈伤组织经体细胞胚发生途径再生的影响因素
• 4.1.1 外植体类型的影响
• 4.1.2 激素的影响
• 4.1.3 光的影响
• 4.1.4 褐化问题
• 4.1.5 体胚的萌发问题
• 4.2 影响百合遗传转化的因素
• 4.2.1 抗生素敏感实验
• 4.2.2 酚类物质的添加
• 4.2.3 假转化体问题
• 4.3 转基因植株的检测
• 5 结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 图版及图版说明
• 攻读学位期间发表的学术论文