自组装环肽纳米管介导的药物跨膜转运及其抗肿瘤活性研究

论文摘要

恶性肿瘤是严重威胁人类健康的最主要疾病之一,长期以来除了手术治疗、放疗以外,化疗是最重要的治疗手段。然而,由于肿瘤细胞对化疗药物的敏感性降低以及多药耐药的产生,往往导致化疗的效果不佳甚至失败。寻找全新途径增强肿瘤细胞对化学药物的敏感性,克服MDR,成为肿瘤化学治疗的当务之急。细胞膜作为细胞的天然屏障是阻碍化疗药物进入肿瘤细胞的主要因素,而膜转运蛋白的外排作用使化疗药物进入肿瘤细胞变得更加困难。若能采取适宜的手段突破细胞膜屏障使化疗药物快速地以高浓度进入细胞内,将削弱肿瘤细胞的外排作用,从而大大增强化疗药物的药理作用,使肿瘤细胞在尚未产生耐药性之前而死亡。本文的目的是研究能够在细胞膜脂质双分子层中自组装形成环肽纳米管跨膜通道,考察其介导小分子抗肿瘤药物跨人工脂质膜转运的情况,以及评价该介导作用对于肿瘤细胞和实体瘤的抑制效果。本文主要内容包括:环肽合成和环肽纳米管制备与表征、环肽纳米管介导小分子药物跨人工脂质膜转运、环肽纳米管介导的5-氟尿嘧啶跨细胞膜转运、环肽纳米管介导5-氟尿嘧啶跨膜转运的体外抗肿瘤细胞活性和S180实体瘤小鼠体内抑瘤活性的考察、环肽纳米管分子动力学模拟研究。根据目标环肽cyclo[-（Trp-D-Leu）4-Gln-D-Leu-]的结构特点和性质,采取了先固相法合成前体线型肽,再液相环合制备环肽的两步法策略。合成的环肽纯度＞95%,总收率30～35%,通过HPLC、LC/MS、1H-NMR等手段验证了其结构。在成功合成环肽的基础上,在溶液条件下制备了环肽纳米管的针状或短棒状结晶。纳米管内部管道区域呈亲水性,能使水溶性小分子物质通过,而其外壁性质取决于环肽氨基酸残基的性质。环肽cyclo[-（Trp-D-Leu）4-Gln-D-Leu-]主要由疏水性氨基酸组成,因此该环肽形成的纳米管外壁具有很强的亲脂性,能够嵌入脂质膜中形成跨膜通道。本文制备了5-氟尿嘧啶（5-FU）、替加氟、顺铂和阿糖胞苷的大单室脂质体,考察了环肽在脂质体膜上自组装形成纳米管后介导这四种药物的跨膜转运情况。药物转运研究表明,环肽纳米管能够介导小分子亲水性药物通过其水性孔道实现跨人工脂质膜的转运,而药物的分子大小是影响其转运速率以及能否被转运的主要因素。比纳米管范德华内径小的5-FU、替加氟、顺铂能够被转运,而较大的阿糖胞苷则无法转运。5-FU、替加氟、顺铂的一级速率常数（k）和90 min累计转运百分率与环肽的加入量呈正相关,曲线拟合的结果证实环肽纳米管介导小分子药物的跨膜转运符合一级释放动力学特征,其转运机制不同于药物载体介导的非线性动力学转运。5（6）-羧甲基荧光素脂质体的膜通透性实验则证实了环肽纳米管与脂质膜的作用机制不是破坏膜结构的完整性,而是嵌入脂质膜双分子层形成水性的孔道而发挥其介导小分子药物转运的功能。在人工脂质膜的研究基础上,选取了BEL7402和Hela两种肿瘤细胞来考察环肽在细胞膜上自组装形成纳米管后对5-FU抗肿瘤活性的影响。BEL7402和Hela细胞的药物敏感性实验显示在环肽纳米管的介导转运下,两种细胞对5-FU的敏感性均有了不同程度的提高。该结果同时说明环肽纳米管介导小分子药物对肿瘤细胞的协同作用机制是没有细胞选择性的。细胞形态学研究和流式细胞仪实验表明环肽纳米管对肿瘤细胞具有细胞毒性,能够诱导肿瘤细胞的凋亡。环肽纳米管和5-FU联合作用于细胞时,环肽纳米管通过介导5-FU的跨膜转运对其抑瘤作用有着显著的促进和增强作用。抗肿瘤药物必须进入肿瘤细胞内才能产生抑制效果,而细胞膜的屏障作用却使药物的入胞变得困难。BEL7402细胞的5-FU摄取实验证实了环肽纳米管能够在细胞膜上形成跨膜的水性通道,从而介导小分子亲水性药物5-FU绕过膜屏障快速地进入肿瘤细胞内。该介导作用提高了5-FU细胞摄取量,从而能够更快地产生抑制效果。而且当环肽的加入量增加时,入胞的通道越多,药物进入的越快,细胞摄取量也越多。在体外细胞实验的基础上,进一步地研究了小鼠体内环境下环肽纳米管介导5-FU对S180实体瘤的联合抑制效果。通过放射标记和活体成像技术证实环肽经瘤内注射给药后绝大部分集中于给药部位,该分布特点有利于提高局部药效和降低全身毒性。环肽纳米管介导5-FU对S180实体瘤的抑制实验表明,经瘤内注射给药,5-FU在环肽所形成的纳米管介导下其抗肿瘤效果得到了增强。对二者联合作用的分析表明,环肽在较低剂量时与5-FU联合用药产生加合抑瘤作用,而在较高剂量时则与5-FU联合用药则产生协同抑瘤作用。实体瘤组织切片观察表明,环肽纳米管介导的5-FU组抑瘤效果明显强于5-FU单独应用组。增加环肽的给药量,5-FU的抑瘤作用也相应得到增强。分子动力学是在分子力学的基础上描述分子运动的一种方法,是研究生物大分子动态模拟的有力工具。本文采用InsightⅡ软件从头构建了三种拓扑异构体环肽纳米管（ortho-nanotubes,meta-nanotubes,para-nanotubes）的PDB结构文件。然后对三种拓扑异构体环肽纳米管进行了分子动力学模拟研究,系统分析了三种环肽纳米管结构稳定性以及相关影响因素,证实了Gln残基的相对位置对环肽纳米管的稳定性和在生物膜上的状态的影响。最后选取了结构最稳定的ortho-nanotubes进行了拉伸动力学的初步研究,揭示了5-FU通过环肽纳米管时的转运机制和受力变化情况。研究表明,5-FU通过环肽纳米管时在其空间位阻作用下是以“跳跃性”的方式通过各个环肽亚单位的。5-FU分子只有采取垂直于环肽平面的构象时才能够穿过该环肽,而如果5-FU分子是平行于环肽平面,则需要较大的拉力来改变其构象使其垂直而穿过环肽。

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中文摘要

Abstract

前言

第一章环肽纳米管的研究综述

1 自组装环肽纳米管的结构特点

1.1 自组装环肽纳米管的设计原则

1.2 自组装环肽纳米管的孔径及分子构象

1.3 环肽氨基酸组成及环肽纳米管的表面性质

1.4 自组装环肽纳米管的稳定性

2 自组装环肽纳米管形成的跨膜离子通道

3 新型抗菌剂——D,L-α-环肽自组装纳米管

4 环肽纳米管在药物递送中的可能应用

5 小结

6 参考文献

第二章环肽cyclo[LWLWLWLWLQ]的合成和环肽纳米管的制备

1 材料和仪器

1.1 药品和试剂

1.2 仪器

2 环肽合成方案

2.1 环肽cyclo[LWLWLWLWLQ]结构式

2.2 环肽cyclo[LWLWLWLWLQ]的合成方案

2.3 线型肽和环肽的半制备和HPLC分析

3 环肽cyclo[LWLWLWLWLQ]的表征

3.1 液相色谱HPLC鉴定

3.2 LC/MS鉴定

1H-NMR鉴定'>3.3¹H-NMR鉴定

4 环肽纳米管的制备

4.1 环肽纳米管的制备方法

4.2 环肽纳米管的表征

5 讨论

6 本章小结

7 参考文献

第三章环肽纳米管介导的小分子水溶性药物跨人工脂质膜转运的研究

1 材料和仪器

1.1 药品、试剂、耗材

1.2 仪器

2 实验部分

2.1 环肽纳米管对脂质体膜通透性的影响考察

2.1.1 原理

2.1.2 脂质体的制备（逆向蒸发法）

2.1.3 脂质体膜通透性测定测定

2.2 模型药物的选择

2.3 环肽纳米管介导的H+跨人工脂质膜转运考察

2.3.1 5（6）-羧基荧光素脂质体的制备（逆向蒸发法）

2.3.2 环肽纳米管介导的H+跨人工脂质膜转运

2.4 环肽纳米管介导的5-氟尿嘧啶（5-FU）跨人工脂质膜转运考察

2.4.1 5-FU脂质体的制备

2.4.2 5-FU脂质体的表征

2.4.3 5-FU的HPLC方法学考察

2.4.4 环肽纳米管介导5-FU跨人工脂质膜转运考察

2.5 环肽纳米管介导的替加氟跨人工脂质膜转运考察

2.5.1 替加氟脂质体的制备

2.5.2 替加氟脂质体的表征

2.5.3 替加氟的HPLC方法学考察

2.5.4 环肽纳米管介导替加氟跨人工脂质膜转运考察

2.6 环肽纳米管介导的顺铂跨人工脂质膜转运考察

2.6.1 顺铂脂质体的制备

2.6.2 顺铂脂质体的表征

2.6.3 顺铂的原子吸收测定的方法学考察

2.6.4 环肽纳米管介导顺铂的跨膜转运

2.7 环肽纳米管介导的阿糖胞苷跨人工脂质膜转运考察

2.7.1 阿糖胞苷脂质体的制备

2.7.2 阿糖胞苷脂质体的表征

2.7.3 阿糖胞苷的HPLC方法学考察

2.7.4 环肽纳米管介导阿糖胞苷的跨膜转运

3 结果和讨论

3.1 环肽纳米管对脂质体膜通透性的影响考察

3.2 环肽纳米管介导的H+跨人工脂质膜转运考察

3.3 5-FU的HPLC方法学考察

3.4 替加氟的HPLC方法学考察

3.5 顺铂的原子吸收测定方法学考察

3.6 阿糖胞苷的HPLC方法学考察

3.7 模型药物脂质体的表征

3.8 环肽纳米管介导的小分子抗肿瘤药物跨人工脂质膜转运

4 本章小结

5 参考文献

第四章环肽纳米管介导5-氟尿嘧啶抗肿瘤细胞活性研究

1 材料和仪器

1.1 细胞系

1.2 药品、试剂和耗材

1.3 仪器

2 实验部分

2.1 肿瘤细胞培养条件

2.1.1 人肝癌BEL-7402肿瘤细胞的培养条件

2.1.2 人结肠癌Hela肿瘤细胞的培养条件

2.2 环肽纳米管对BEL-7402细胞膜流动性的影响

2.3 药物敏感实验（MTT法）

2.3.1 环肽对BEL7402细胞的细胞毒性考察

2.3.2 环肽纳米管介导5-FU内转运对BEL7402细胞的药物敏感性影响

2.3.3 环肽对Hela细胞的细胞毒性考察

2.3.4 环肽纳米管介导5-FU内转运对Hela细胞的药物敏感性影响

2.3.5 MTT溶液配制

2.3.6 MTT实验

2.4 环肽纳米管介导的BEL7402细胞对5-FU的摄取

2.4.1 细胞样品的高效液相色谱分析方法的建立（内标法）

2.4.2 5-FU浓度和作用时间对摄取的影响

2.5 形态学考察

2.6 流式细胞仪实验

3 结果与讨论

3.1 环肽纳米管对BEL7402细胞膜流动性的影响

3.2 药物敏感实验（MTT法）

3.2.1 环肽对BEL7402细胞的细胞毒性考察

3.2.2 环肽纳米管介导5-FU内转运对BEL7402细胞的药物敏感性考察

3.2.3 环肽对Hela细胞的细胞毒性考察

3.2.4 环肽纳米管介导5-FU内转运对Hela细胞的药物敏感性考察

3.3 环肽纳米管介导的BEL7402细胞对5-FU的摄取

3.3.1 细胞样品的高效液相色谱分析方法的建立（内标法）

3.3.2 5-FU浓度和作用时间对摄取的影响

3.3.3 环肽纳米管介导BEL7402细胞对5-FU摄取实验

3.4 形态学考察

3.5 流式细胞仪实验

4 本章小结

5 参考文献

第五章环肽纳米管介导5-氟尿嘧啶对S180实体瘤小鼠的抑瘤活性研究

1 材料、仪器和动物

1.1 材料

1.2 仪器

1.3 移植瘤和实验动物

2 实验部分

2.1 荷瘤S180小鼠模型的建立

2.2 125I-cyclo[LWLWLWLWLQ]瘤内注射后的小鼠体内分布研究

2.2.1 cyclo[LWLWLWLWLQ]的125I放射标记（Iodogen法）

2.2.2 125I-cyclo[LWLWLWLWLQ]的纯化

2.2.3 125I-cyclo[LWLWLWLWLQ]瘤内注射后的小鼠体内分布

2.3 环肽纳米管介导5-FU对S180实体瘤小鼠的药效学考察

2.3.1 5-FU和CP浓度对药效的影响

2.3.2 环肽纳米管介导5-FU对S-180实体瘤小鼠的药效考察

2.3.3 病理组织学检查

3 结果和讨论

3.1 125I-cyclo[LWLWLWLWLQ]瘤内注射后的小鼠体内分布研究

3.1.1 125I-cyclo[LWLWLWLWLQ]的放化纯度测定

3.1.2 125I-cyclo[LWLWLWLWLQ]瘤内注射后的小鼠体内分布

3.2 环肽纳米管介导5-FU对S180实体瘤小鼠的药效学考察

3.2.1 5-FU浓度对其抑瘤效果的影响

3.2.2 环肽浓度对其抑瘤效果的影响

3.2.3 环肽纳米管介导5-FU对S180实体瘤的抑瘤药效考察

3.2.4 病理组织学检查

4 本章小结

5 参考文献

第六章环肽纳米管的分子动力学模拟研究

1 分子动力学的基本原理

2 环肽纳米管的分子动力学模拟研究

2.1 模型构建

2.1.1 环肽纳米管分子模型的构建

2.1.2 环肽纳米管-磷脂双层模结构的构建

2.2 分子动力学模拟方法

2.3 模拟结果

2.3.1 三种拓扑异构环肽纳米管稳定性比较

2.3.2 环肽纳米管受力情况分析

2.3.3 ortho-nanotubes环肽纳米管的稳定性分析

3 环肽纳米管介导5-氟尿嘧啶跨膜转运的拉伸动力学研究

3.1 拉伸动力学模拟的方法

3.2 模拟结果

3.2.1 拉力速度的确定

3.2.2 5-FU通过环肽纳米管跨膜转运的拉伸动力学过程

4 本章小结

5 参考文献

全文总结

致谢

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