生物质谱技术和方法在蛋白类药物序列鉴定中的应用研究

生物质谱技术和方法在蛋白类药物序列鉴定中的应用研究

论文摘要

在生物仿制药出现以后,为保证它与原研产品功能的一致性,保证它的质量、安全和效能,首先需要对它的结构进行表征,包括完整蛋白分子量测定,氨基酸序列鉴定,各类修饰,如二硫键、糖链的鉴定等。本论文的研究主要集中在使用生物质谱技术对两种蛋白类药物分子,重组人生长激素和重组卵泡刺激素进行表征,对完整蛋白分子量,氨基酸序列,各类修饰,特别是糖链序列进行测定和解析。本论文第二章的工作是对蛋白药PEG(聚乙二醇)修饰的重组人生长激素进行氨基酸的序列鉴定。还原烷基化实验后,使用UPLC-MS/MS仪器在正离子模式下进行液质联用在线分析,使用Uniprot数据库进行匹配搜索,鉴定到198条肽段,我们对原始数据和搜库结果进行了深入分析和总结,经过人工再次评估,结合一级质谱谱图,鉴定到的肽段达到204条,序列覆盖率几乎达到百分百,还发现了除胰蛋白酶酶解肽段外非正常胰蛋白酶酶解肽段的氨基酸序列,鉴定到诸如氨基酸替代,氧化、脱水、脱氨基等大量重要的化学修饰信息。这些信息对于蛋白类药物分子的氨基酸序列鉴定非常有意义,这对于鉴定肽段信息,准确鉴定蛋白分子结构,对鉴别其结构与功能方面的关系等提供了重要的信息。论文第三章涉及的是对N-糖蛋白完整分子量的测定以及对从该蛋白PNGase F酶解分离得到的N-糖链的序列解析。对N-糖蛋白完整分子量的测定,得到了两个亚基的分子量,并且得知其中含有唾液酸和六元糖的糖单元。由于唾液酸的存在,在对N-糖糖链进行液质联用在线解析时,采用负离子模式,结合总离子流图(TIC)和提取离子流图(XIC)及MS和MS/MS谱图,在Analyst软件上进行数据分析,找到了糖链碎裂的分子离子峰,推断出可能的糖链序列组成。此外,我们试图建立一种标准化的流程方法来解析糖蛋白中的糖链序列,由于还原端的衍生化可以简化谱图,特别是碎片离子的质量谱图,提高离子化效率,我们尝试用2-AB(2-氨基苯甲酰胺)这种荧光试剂进行糖链的衍生化。在前期对标记方法的尝试和摸索阶段,先使用六个葡萄单糖聚合的简单结构的麦芽六糖(Maltohexaose),标记反应完成后分离纯化除去过量的标记试剂,浓缩后进行质谱分析。首先使用MALDI-TOFTOF高分辨质谱,找到分子量增加120.06 Da的标记分子的加钠离子峰,然后使用UPLC-ESI-MS/MS液质联用在线检测,糖链标记前后1:1进样,观测到标记后麦芽六糖的质子峰信号强度明显增强,说明对于中性糖的标记是很有效果的,结合串级质谱谱图,进一步确认了这个糖链结构,然后把该方法应用到实际N-糖蛋白的糖链上,也取得了一定的效果。应用质谱技术对蛋白类药物的表征,包括完整蛋白分子量分析,对氨基酸的序列分析,对各类修饰,特别是N-糖糖链的解析,有助于对蛋白类药物的结构鉴定,帮助蛋白仿制药和原研产品进行比较性研究,能更真实地反应出两者之间的相似与不同,对蛋白仿制药物分子的鉴定也更具体,有针对性,更真实可靠。

论文目录

  • 目录
  • 摘要
  • Abstract
  • 第一章 绪论
  • 1.1 蛋白类药物的进展
  • 1.1.1 蛋白类药物的特点
  • 1.1.2 生物仿制药的出现
  • 1.1.3 目前对生物类药品的表征
  • 1.2 质谱技术的进展
  • 1.2.1 质谱的发展
  • 1.2.2 离子源技术进展
  • 1.2.3 质量分析器技术进展
  • 1.2.4 串联质谱
  • 1.3 蛋白质氨基酸序列的质谱测定
  • 1.3.1 氨基酸测序的意义
  • 1.3.2 氨基酸测序的方法简介
  • 1.3.3 氨基酸序列的搜库
  • 1.4 糖蛋白组学中糖序列解析
  • 1.4.1 糖基化修饰的意义
  • 1.4.2 糖基化蛋白的研究现状
  • 1.4.3 糖链的序列解析方法
  • 1.4.3.1 糖链释放方法
  • 1.4.3.2 糖链标记方法
  • 1.4.3.3 糖链分离方法
  • 1.4.3.4 糖链的质谱鉴定
  • 第二章 蛋白类药物分子的肽图分析研究
  • 2.1 背景介绍
  • 2.2 实验部分
  • 2.2.1 材料和试剂
  • 2.2.2 蛋白的溶液酶解
  • 2.2.3 液质联用在线检测
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 鉴定到的重组人生长激素的肽段氨基酸序列与理论序列比较
  • 2.3.2 鉴定到的肽段后修饰等信息分析
  • 第三章 糖蛋白类药物分子糖谱的解析
  • 3.1 背景介绍
  • 3.2 实验部分
  • 3.2.1 材料与试剂
  • 3.2.2 标记糖链
  • 3.2.3 MALDI质谱分析
  • 3.2.4 UPLC-ESI液质联用分析
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 N-糖蛋白的完整分子量测定
  • 3.3.2 糖链序列的解析
  • 3.3.3 标记麦芽六糖的结果
  • 3.3.4 麦芽六糖标记后的分离方法
  • 3.3.5 实际样品的标记结果
  • 第四章 总结和展望
  • 附表1 鉴定PEG化的重组人生长激素的氨基酸序列中发现的后修饰信息
  • 参考文献
  • 致谢
  • 相关论文文献

    • [1].重组蛋白类药物蛋白含量测定方法探究[J]. 智慧健康 2020(27)
    • [2].基于生物可降解高分子的蛋白类药物纳米递送系统研究进展[J]. 中国药科大学学报 2017(02)
    • [3].脂质体作为多肽、蛋白类药物载体应用研究的进展(上)[J]. 中国药师 2010(04)
    • [4].蛋白类药物缓释微球制剂的研究进展[J]. 临床药物治疗杂志 2015(03)
    • [5].固载蛋白类药物的壳聚糖基管式膜的制备及体外缓释性能研究[J]. 湖北民族学院学报(自然科学版) 2012(03)
    • [6].微囊化工艺和相关辅料对蛋白类药物稳定性的影响[J]. 中国医药工业杂志 2009(04)
    • [7].LC-MS/MS法测定肽类及蛋白类药物时残留效应的研究进展[J]. 中国新药杂志 2017(20)
    • [8].胰岛素样生长因子-1衍生物的研究进展[J]. 江汉大学学报(自然科学版) 2019(06)
    • [9].Nat Commun:科学家或制造出更好的酶类和蛋白类药物[J]. 现代生物医学进展 2016(12)
    • [10].抗蛋白粘附表面的制备与表征[J]. 生物技术世界 2014(08)
    • [11].DNA改组技术及其在蛋白类药物定向进化中的应用[J]. 中国药物与临床 2008(08)
    • [12].IL-6/IL-6R蛋白类药物治疗RA专利技术分析[J]. 中国科技信息 2019(14)
    • [13].重组蛋白类药物蛋白含量测定方法研究进展[J]. 药学研究 2018(03)
    • [14].蛋白类药物聚乙二醇修饰的研究[J]. 中国煤炭工业医学杂志 2008(02)
    • [15].蛋白类药物冷冻干燥技术的研究进展[J]. 武警医学院学报 2010(01)
    • [16].LC-MS分析生物样品中肽类及蛋白类药物的技术问题及其解决方案[J]. 中国药科大学学报 2010(05)
    • [17].基因治疗的曙光[J]. 人与生物圈 2018(06)
    • [18].脂质体肺部给药的研究进展[J]. 中国医院药学杂志 2008(17)
    • [19].长效化融合蛋白药物及其药动学分析技术的研究进展[J]. 中国生物工程杂志 2017(04)
    • [20].生物类似药糖基化相似性评价中的审评思考[J]. 中国新药杂志 2020(21)
    • [21].壳聚糖凝胶用于蛋白类药物结肠靶向缓释性能研究[J]. 南阳师范学院学报 2009(09)
    • [22].柔性纳米脂质体构建肺部靶向给药系统的研究[J]. 中国现代应用药学 2017(01)
    • [23].制备壳聚糖负载乳铁蛋白微粒的研究进展[J]. 黑龙江科学 2016(19)
    • [24].赛默飞顺利举办2014生物制药质谱分析技术进展研讨会[J]. 石油化工自动化 2015(01)
    • [25].自主研发 打造国际知名生物制药企业[J]. 科技成果纵横 2010(06)
    • [26].重组抗肿瘤抗病毒蛋白的三维结构预测及其与受体的相互作用分析[J]. 药物分析杂志 2014(12)
    • [27].壳聚糖的纳米载体应用于口服蛋白类药物/疫苗递送的研究[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版) 2017(05)
    • [28].一种新型蛋白类药物口服载体的海藻酸钠/巯基化果糖-壳聚糖复合水凝胶[J]. 生物学杂志 2013(01)
    • [29].糖蛋白药物糖基化及其表达系统的研究进展[J]. 安徽医药 2008(01)
    • [30].人干扰素的作用原理与应用[J]. 生物学通报 2015(03)

    标签:;  ;  ;  ;  ;  

    生物质谱技术和方法在蛋白类药物序列鉴定中的应用研究
    下载Doc文档

    猜你喜欢