论文摘要
目的构建insig2真核表达转染载体pcDNA3.1（+）-insig2，转染3T3-L1细胞并观察对3T3-L1细胞细胞周期及凋亡的影响、insig-SREBPS-SCAP-下游基因信号通路中各基因的表达及其对脂肪细胞的合成和分化影响。方法采用RT-PCR法从3T3-L1细胞获取小鼠全长insig2基因，并克隆入真核表达载体pcDNA3.1（+）中，PCR、酶切及测序鉴定后，经脂质体转染入3T3-L1细胞。通过RT-PCR、免疫细胞化学法检测insig2基因在pcDNA3.1（+）-insig2转染组、pcDNA3.1（+）组及未转染的3T3-L1细胞中的表达；流式细胞仪检测转染insig2基因后对3T3-L1细胞周期及凋亡的影响；油红“O”染色分析其对脂肪细胞的分化影响；RT-PCR法检测脂肪细胞的分化过程中insig2及insig1、SREBPS、SCAP、AP2、FAS mRNA表达。结果1、酶切、测序鉴定所插入片段的大小和基因序列准确无误，成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1（+）-insig2。2、转染pcDNA3.1（+）-insig2后，RT-PCR检测和免疫细胞化学法分析结果显示，insig2 mRNA及蛋白表达较pcDNA3.1（+）、3T3-L1细胞组均显著增加，提示pcDNA3.1（+）-insig2成功转染3T3-L1细胞并高效表达。3、转染insig2后对3T3-L1细胞细胞周期及凋亡率无明显影响（P＞0.05），细胞生长曲线也无明显变化（P＞0.05）。4、诱导分化过程中油红“O”染色显示转染pcDNA3.1（+）-insig2组细胞诱导分化第6天及第12天脂肪细胞均较3T3-L1细胞组及转染pcDNA3.1（+）组脂肪细胞分化明显减少（P＜0.05），而3T3-L1细胞组与转染pcDNA3.1（+）组脂肪细胞分化程度无明显差别（P＞0.05）。5、在诱导分化过程中，随着诱导分化天数的增加，三组细胞insig2、insig1、SREBPS、FAS、AP2 mRNA表达均逐渐上调，而SCAP mRNA则无明显变化；与转染pcDNA3.1（+）及3T3-L1细胞组比较，pcDNA3.1（+）-insig2转染组细胞insig2 mRNA的表达显著上调（P＜0.05），insig1、SREBPS、FAS、AP2 mRNA表达均下调（P＜0.05），以FAS、AP2 mRNA下调明显，而SCAP mRNA则无明显差异（P＞0.05）。结论成功构建了真核表达质粒pcDNA3.1（+）-insig2，转染3T3-L1细胞，获得insig2基因高表达的阳性细胞株，过表达insig2对3T3-L1细胞细胞周期及凋亡率无明显影响，对脂肪细胞的分化及相关基因的表达具有抑制作用。
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