黄孢原毛平革菌木质素降解酶系的生产、纯化及在合成手性亚砜中的应用

论文摘要

黄孢原毛平革菌在发酵条件下可以同时生产乙二醛氧化酶、木素过氧化物酶和锰过氧化物酶等木质素降解酶系,但在不同的条件如限氮、限碳、空气或高氧环境下三种酶的生产能力有所不同。本文将在摇瓶中重点研究限碳培养黄孢原毛平革菌生产乙二醛氧化酶,对其发酵工艺条件进行优化。在鼓泡塔中研究生产乙二醛氧化酶、木素过氧化物酶和锰过氧化物酶等三种木质素降解酶系。酶系经过适当的纯化后,再进行固定化和催化苯甲硫醚生成手性苯甲亚砜的应用研究。在摇瓶中,黄孢原毛平革菌限氮和限碳培养都能合成乙二醛氧化酶,限碳培养时利用聚氨酯泡沫固定化菌体能更有效地合成乙二醛氧化酶。乙二醛氧化酶的底物,如丙酮醛、乙二醛等,不能诱导乙二醛氧化酶的合成,而黎芦醇、苯甲醇能较好的诱导乙二醛氧化酶的合成。Fe2+、Cu2+对乙二醛氧化酶的合成影响不大;Mn2+对乙二醛氧化酶影响较大,浓度在2.96×10-5mol/L时酶活力较高。空气环境中能合成乙二醛氧化酶,但效果不如通氧。经过优化后摇瓶限碳培养能获得乙二醛氧化酶活力为29.1U/L。在鼓泡塔限碳培养黄孢原毛平革菌时,其乙二醛氧化酶产酶周期与摇瓶培养相同,在第5天活力最高,达到20.1U/L。在通气量试验时,通1.0vvm的空气比较适合产酶。通入气体为含氧空气时,发现通入含氧50%80%的空气能提高产量20%左右;利用相同的固定化菌体进行重复分批培养时,重复培养3批后活力还能维持在10U/L以上。用鼓泡塔限氮培养固定化黄孢原毛平革菌时,通入80%氧气含量的空气,通气量维持在0.75vvm,木素过氧化物酶和锰过氧化物酶在第5天达最高活力,分别为311.8U/L和68.2U/L,乙二醛氧化酶的活力较低,为10.1U/L。限碳发酵液经过浓缩、盐析、透析等纯化步骤,能得到活力为233.6U/L、比活力为283.7U/g的乙二醛氧化酶酶液,分别比纯化前提高9.6倍和1.8倍。限氮发酵液经过盐析、透析、DEAE-Sepharose离子交换等步骤,能得到活力分别为1137.5U/L、241.0U/L的木素过氧化物酶和锰过氧化物酶的酶液,分别提高3.8倍和3.0倍。酶液经SDS-PAGE电泳鉴定得出,木素过氧化物酶LiP分子量约为42 kDa,锰过氧化物酶MnP分子量约为47 kDa,与相关文献报道相似。以聚氨酯泡沫为载体的共价结合法能有效地固定木素过氧化物酶、锰过氧化物酶和乙二醛氧化酶,得到的固定化酶的活力分别为0.11U/g、0.036U/g和0.015U/g,酶活力回收分别为25.6%、39.1%和21.4%。使用混合酶液,且利用在不同的pH下Lip和Mnp催化活力的巨大差异可得:木素过氧化物酶催化苯甲硫醚能生成R型过量的苯甲亚砜,e.e.值为30.7%,转化率为28.4%;锰过氧化物酶催化的苯甲硫醚产生的苯甲亚砜以S型过量,e.e.值为36.2%,转化率为20.8%。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 文献综述
• 1.1 黄孢原毛平革菌简介
• 1.1.1 黄孢原毛平革菌生物学性征
• 1.1.2 黄孢原毛平革菌木质素降解酶系
• 1.2 乙二醛氧化酶的研究进展
• 1.2.1 乙二醛氧化酶的酶学性质、结构和分子生物学
• 1.2.2 乙二醛氧化酶的催化特性
• 1.2.3 黄孢原毛平革菌合成乙二醛氧化酶的条件
• 1.2.4 乙二醛氧化酶的分离纯化
• 1.3 木素过氧化物酶的研究进展
• 1.3.1 木素过氧化物酶的结构和性质
• 1.3.2 木素过氧化物酶的催化反应
• 1.3.3 木素过氧化物酶的纯化
• 1.4 锰过氧化物酶的研究进展
• 1.4.1 锰过氧化物酶的结构和性质
• 1.4.2 锰过氧化物酶的催化机制
• 1.4.3 锰过氧化物酶的纯化
• 1.5 酶的固定化技术
• 1.5.1 过氧化物酶的固定化研究进展
• 1.5.2 酶的聚氨酯泡沫固定化技术
• 1.6 过氧化物酶的应用
• 1.6.1 过氧化物酶的应用研究
• 1.6.2 过氧化物酶在催化合成手性亚砜中的应用
• 1.7 本课题的研究内容及技术路线
• 第二章 固定化黄孢原毛平革菌生产乙二醛氧化酶的研究
• 2.1 材料与方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 游离细胞限氮培养合成乙二醛氧化酶的一般规律
• 2.2.2 游离细胞和固定化细胞限碳培养合成乙二醛氧化酶
• 2.2.3 乙二醛氧化酶诱导剂的选择
• 2+、Fe²⁺、Cu²⁺对生产乙二醛氧化酶的影响'>2.2.4 Mn²⁺、Fe²⁺、Cu²⁺对生产乙二醛氧化酶的影响
• 2.2.5 氧浓度对产乙二醛氧化酶GLOX的影响
• 2.3 本章小结
• 第三章 鼓泡塔生产木质素降解酶系的研究
• 3.1 材料与方法
• 3.2 结果与讨论
• 3.2.1 鼓泡塔限碳培养生产乙二醛氧化酶的研究
• 3.2.2 鼓泡塔限氮培养生产木素降解酶系的研究
• 3.3 本章小结
• 第四章 黄孢原毛平革菌木质素降解酶系的提取和纯化
• 4.1 材料与方法
• 4.2 结果与讨论
• 4.2.1 盐析与透析
• 4.2.2 DEAE-sepharose离子交换层析
• 4.2.3 纯化步骤分析
• 4.2.4 SDS-PAGE结果与分析
• 4.3 本章小结
• 第五章 木质素降解酶系的固定化及合成手性亚砜的研究
• 5.1 材料与方法
• 5.2 结果与讨论
• 5.2.1 固定化酶的研究
• 5.2.2 木素过氧化物酶催化苯甲硫醚生成苯甲亚砜
• 5.2.3 锰过氧化物酶催化苯甲硫醚生产苯甲亚砜
• 5.3 本章小结
• 总结与建议
• 一 总结
• 二 建议
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士期间发表的学术论文目录