酿酒酵母SDT1和CDC73的结构生物学研究

论文摘要

核苷酸酶是一个非常重要的水解酶家族,它们能够将核苷单磷酸水解成核苷和磷酸根离子,与核苷酸激酶所参与的生物学过程互补,以保证细胞内核苷单磷酸库的平衡。作为一类生命基本活动所必需的酶,核苷酸酶参与了转录,翻译和信号转导等一系列的生物学过程中,从原核生物到真核生物体内都发现了这类酶的存在。从分类学的角度来说,核苷酸酶一般都属于HAD（Haloalkanoate dehalogenase）水解酶大家族,SDT1是一种酿酒酵母源的高度特异性的嘧啶核苷酸酶,参与到酵母的转录过程中。我们表达纯化了SDT1的全长和截去N端的蛋白,并解析了截去N端的蛋白的晶体结构。通过结构分析我们发现,SDT1由帽子结构域和核心结构域两部分组成,两个结构域共同形成了一个经典的α/βRossmann桶的折叠花样,已经解析的HAD水解酶大家族成员一般都采取这种折叠花样。而酶活中心也正是位于这两个结构域之间。进一步,通过浸泡底物的方法,得到了底物和SDT1的复合物结构。通过对复合物的结构解析,我们解释了SDT1的底物特异性的特点,对酶活的机制也有了更深的理解,为进一步酶抑制剂和嘧啶特异性的核苷酸酶抗性药物设计提供了结构基础。真核生物的转录是一个高度保守的生物学过程, RNA聚合酶II是整个转录过程中起中心角色的蛋白质分子。RNA聚合酶II通过与一系列的辅助因子相互作用,调节着转录的起始、延伸、暂停和终止。RNA聚合酶II相关蛋白1复合物PAF1（RNA Polymerase-Associated Factor 1）在转录的全过程中都结合在RNA聚合酶II上,发挥重要的作用。作为PAF1复合物最早被发现的两个组分之一,CDC73参与到许多转录相关的过程中:结合到RNA聚合酶II上,招募和激活组蛋白调节因子以及其它转录激活因子的信号转导。然而到目前为止,PAF1以及CDC73在转录过程中发挥作用的具体机制并不清楚。我们表达纯化了酿酒酵母源的CDC73全长蛋白和C端结构域片断,并解析了C端结构域的晶体结构。通过结构分析发现,CDC73蛋白的C端结构域折叠成一个类似于小G蛋白的结构花样。虽然在后续的实验中,我们无法检测到CDC73的GTPase活性,但为进一步探索CDC73和PAF1复合物的内在作用机理提供一些线索和结构基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 嘧啶核苷酸酶SDT1 蛋白的结构与功能研究
• 1.1 酿酒酵母源SDT1 蛋白研究进展
• 1.1.1 HALO 酸水解酶家族概述
• 1.1.1.1 HAD 水解酶大家族与其它Rossmann 型折叠花样家族的关联
• 1.1.1.2 HAD 水解酶大家族在核心Rossmannoid 结构域上的变化
• 1.1.1.3 HAD 水解酶大家族的保守结构特征
• 1.1.1.4 HAD 水解酶大家族的帽子结构域
• 1.1.1.5 HAD 水解酶大家族的帽子结构域在催化水解中的作用
• 1.1.2 核苷酸酶家族概述
• 1.1.2.1 大肠杆菌源的胞质核苷酸酶
• 1.1.2.2 胞质内的核糖核苷酸酶
• 1.1.3 SDT1 蛋白研究进展
• 1.2 实验方法和结果
• 1.2.1 SDT1（26-280）-pET-22b 质粒构建
• 1.2.2 SDT1（26-280）的蛋白表达与纯化
• 1.2.3 SDT1（26-280）的酶活测定
• 1.2.4 SDT1（26-280）蛋白的晶体生长条件筛选、优化及晶体衍射数据收集
• 1.2.5 SDT1（26-280）蛋白的衍射数据的处理及结构解析
• 1.2.6 SDT1（26-280）的模型与电子密度图的吻合情况
• 1.2.7 SDT1（26-280）蛋白D61A 突变体的质粒构建、表达纯化、晶体生长以及底物的浸泡
• 1.3 SDT1（26-280）蛋白晶体结构分析以及D61A 突变体与底物相互作用的讨论
• 1.3.1 SDT1（26-280）蛋白的序列分析
• 1.3.2 SDT1（26-280）蛋白的整体晶体结构
• 1.3.3 SDT1 与其它核苷酸酶结构的比较
• 1.3.4 SDT1 的D61A 突变体与底物的复合物结构揭示了SDT1 与底物的结合模式
• 本章小结
• 参考文献
• 第2章 酿酒酵母PAF1 复合物亚基CDC73 蛋白结构与功能研究
• 2.1 PAF1 复合物与CDC73 蛋白的研究进展
• 2.1.1 PAF1 复合物的发现
• 2.1.2 PAF1 复合物参与到转录循环中的过程
• 2.1.3 与PAF1 复合物功能密切相关的生物学过程
• 2.1.3.1 修饰组蛋白
• 2.1.3.2 影响端粒长度和端粒沉默
• 2.1.3.3 影响RNA 聚合酶II 的C 端结构域2 位丝氨酸磷酸化
• 2.1.3.4 影响转录的延伸
• 2.1.3.5 影响mRNA 的3’-末端结构并招募mRNA 的3’-末端切割因子
• 2.1.3.6 影响snoRNA 的3′末端结构
• 2.1.4 与PAF1 复合物有直接相互作用的因子
• 2.1.5 CDC73 的研究进展
• 2.2 实验方法和结果
• 2.2.1 CDC73 （235-393）-pET-22b 质粒构建
• 2.2.2 CDC73 （235-393）蛋白的表达与纯化
• 2.2.3 CDC73 （235-393）蛋白的晶体筛选、数据收集及初步处理
• 2.2.4 CDC73 （235-393）蛋白的结构解析及模型质量分析
• 2.2.5 CDC73 （235-393）蛋白的GTPase 活性的测定
• 2.3 CDC73 （235-393）蛋白晶体结构分析与讨论
• 2.3.1 CDC73 （235-393）蛋白的序列分析及它的整体结构
• 2.3.2 CDC73 （235-393）与其它小G 蛋白的结构比对
• 2.3.3 CDC73 是否是一个G 蛋白
• 本章小结与展望
• 参考文献
• 附录1 试剂与电泳配方
• 附录2 Top10 感受态细胞的制作
• 附录3 质粒图谱
• 附录4 质粒的小量抽提
• 致谢
• 在读期间发表的学术论文与取得的研究成果