猪流行性腹泻病毒部分S基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

猪流行性腹泻病毒部分S基因的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

论文摘要

猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PorcineEpidemic Diarrhea Virus,PEDV)引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病。不同年龄和不同品种的猪对本病都易感,但对哺乳仔猪的危害最为严重,以仔猪呕吐、严重腹泻和脱水为主要临床特征。1周龄以内的哺乳仔猪于开始腹泻后2-4d死亡,致死率高达90%以上,给养猪业造成了严重的经济损失。目前,PED的诊断方法主要有病毒中和试验、免疫荧光法、免疫电镜法、ELISA和RT-PCR法等。随着分子生物学技术的不断发展,间接ELISA法以其敏感性高、特异性强越来越受到人们的重视。对PEDV的研究表明,S基因编码的S蛋白是猪流行性腹泻病毒(PEDV)的主要的结构蛋白,是诱导机体产生中和抗体和提供黏膜免疫保护作用主要的结构蛋白。与GenBank上的其它毒株相比较发现S基因具有很高的保守性,所以重组S蛋白可作为理想的检测抗原用于临床PEDV。本试验为使S蛋白在原核细胞中得以表达,针对S基因的保守区设计并合成了一对扩增部分S基因的引物P1,P2,以pMD18-T-PS阳性克隆质粒为模板,扩增出目的片段S1基因,片段大小约为500bp。同时采用不同的载体系统,探索了S基因的表达效果,即将猪流行性腹泻病毒的部分S基因分别亚克隆到原核表达载体pGEX-6p-1和pET-32a的Sal I和NotI之间的多克隆位点上,进而构建了重组原核表达质粒pGEX-6p-S1和pET-32a-S1。将重组表达质粒pGEX-6p-S1和pET-32a-S1,分别转化到宿主表达菌BL21(DE3)中,用终浓度为1mmol/L的IPTG对宿主表达菌诱导表达。经SDS-PAGE分析表达产物,结果表明:S1基因在原核表达系统pGEX-6p-1和pET-32a中获得表达,表达的重组蛋白大小约为20KD。本实验选择表达量较高的pET-32a-S1原核表达系统,对其进行包涵体提取纯化,得到纯度达90%以上的重组蛋白。Western blot检测表明,表达的重组蛋白能够被PEDV阳性血清所识别。由此说明,表达的重组蛋白具有良好的反应原性。将构建的含有猪流行性腹泻病毒部分S基因原核表达质粒pET-32a-S1进行诱导表达之后,纯化重组蛋白包涵体,通过Western blot检测纯化后蛋白的反应原性。将其作为抗原包被酶标板,优化间接ELISA试验条件,建立可检测PEDV血清抗体的间接ELISA方法。利用已建立的ELISA方法对吉林省猪场进行血清学检测,检测100份临床血清样品,检出总阳性率为88%。试验结果表明,建立的间接ELISA方法敏感、特异,可用于临床PEDV血清抗体的检测。这为ELISA诊断试剂盒的研制开发奠定了基础,为建立规模化猪场PEDV感染的快速诊断方法提供了科学依据。

论文目录

  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 第一部分 前言
  • 1 猪流行性腹泻病毒的研究进展
  • 1.1 病毒的分类及形态特征
  • 1.2 病毒的理化特性
  • 1.3 病毒的培养特性
  • 1.4 病毒的基因组结构和复制
  • 2 PEDV的编码蛋白及其功能
  • 2.1 非结构蛋白及其功能
  • 2.2 结构蛋白及其功能
  • 3 PEDV与其它冠状病毒的抗原相关性
  • 4 PEDV诊断方法的研究进展
  • 4.1 免疫电镜法
  • 4.2 免疫荧光法
  • 4.3 微量血清中和试验
  • 4.4 RT-PCR法
  • 4.5 ELISA法
  • 5 PED诊断试剂的研究进展
  • 6 本实验的目的和意义
  • 第二部分 实验内容
  • 实验一 猪流行性腹泻病毒部分S基因的原核表达
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 2 结果
  • 2.1 目的基因的PCR扩增产物
  • 2.2 原核重组表达质粒的构建
  • 2.3 阳性重组表达质粒的鉴定
  • 2.4 SDS-PAGE分析
  • 2.5 重组蛋白的纯化结果
  • 2.6 Western blot分析
  • 3 讨论
  • 3.1 目的基因的序列分析
  • 3.2 表达系统的选择
  • 3.3 目的蛋白的纯化
  • 3.4 关于免疫印迹
  • 3.5 目的蛋白的活性
  • 实验二 重组质粒间接ELISA检测方法的建立
  • 1 材料与方法
  • 1.1 实验材料
  • 1.2 实验方法
  • 2 结果与分析
  • 2.1 抗原最适包被浓度和抗体最佳稀释度的确定
  • 2.2 酶标二抗工作浓度的确定
  • 2.3 血清及酶标二抗最佳反应时间的确定
  • 2.4 封闭液的确定
  • 2.5 包被条件的确定
  • 2.6 显色时间的确定
  • 2.7 间接ELISA阴、阳性血清临界值的确定
  • 2.8 特异性实验
  • 2.9 重复性实验
  • 2.10 临床血清样品检测
  • 3 讨论
  • 3.1 ELISA工作条件的确定
  • 3.2 抗原的纯度对ELISA的影响
  • 3.3 临床检测结果
  • 结论
  • 参考文献
  • 缩略语表
  • 致谢
  • 个人简介
  • 相关论文文献

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