论文摘要
根结线虫（Root-Knot Nematode, RKN）已经成为植物的一类重要病原物,根结线虫病害已经造成了巨大的农业经济损失。苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）伴随芽胞形产成会生对昆虫具有特异毒性的杀虫晶体蛋白（Insecticidal Crystal Proteins, ICPs）,其中晶体蛋白Cry5Ba对南方根结线虫具有很高的杀虫活性。目前,关于苏云金芽胞杆菌晶体蛋白对昆虫的毒杀机制研究的较多并且非常透彻,但是对于其杀线虫机制的研究较少,具体的毒杀机制也不是很透彻。由于根结线虫是植物专性寄生线虫,二龄后的生活周期都在植物的根内部,且生活周期长,不利于研究工作的展开。秀丽小杆线虫（Caenorhabditis elegans）是生物学研究的理想材料,且具有结构简单、生长周期短、饲养简单、繁殖快等众多优点,且已经完成了全基因组测序,目前已经成为一种理想的模式生物。因此,本研究中以秀丽小杆线虫为材料研究Cry5Ba杀线虫机制的研究,这可以为Bt对根结线虫的生物防治提供重要的理论指导,因此我们展开了如下的研究：1.根据已报道的以穿孔机制杀虫的Bt晶体蛋白Cry1,Cry3等具有5个保守区,能形成3个结构域,通过序列比对发现Cry5Ba也具有4个保守区,且已预测出其空间结构具3个经典结构域；在本室的其他研究中发现Cry5Ba在秀丽小杆线虫体内形成寡聚体；秀丽小杆线虫存在着一个庞大的钙粘蛋白超家族（Cadherin Superfamily）,包含13种不同的钙粘蛋白,本研究通过信息学比较和分析,发现秀丽小杆线虫中的钙粘蛋白CDH-8, CDH-7与昆虫中的钙粘蛋白受体进化地位最近,而且具有一定的序列相似性,且cdh-8和cdh-7是线虫所特有的。综上所述,推测CDH-8和CDH-7可能是Cry5Ba在C.elegans中的受体。2.Cry5Ba对C. elegans cdh-8突变体RB815 LCso的生物测定实验结果表明RB815对Cry5Ba产生了非常明显的抗性。3.关于昆虫钙粘蛋白毒素结合区的报道主要集中在CR7-MPED,通过比对发现CDH-8的CR7-MPED与昆虫的昆虫钙粘蛋白毒素结合区具有较高的同源性。因此选择对CDH-8的CR7-MPED区域进行分段克隆,设计三对特异性引物进行CDH-8的CR7-MPED分段克隆,得到了以下3个片段的编码序列：CR7、CR9-CR10和CR10-MPED,通过表达纯化得到相应多肽。4.通过Ligand blot实验,发现CR7、CR9-CR10和CR10-MPED均能与Cry5Ba结合。5.通过竞争性结合实验,发现只有CR9-CR10能与Cry5Ba专一性结合,进一步说明CDH-8可能是Cry5Ba的受体。这些研究为研究苏云金芽胞杆菌晶体蛋白杀线虫机制提供了重要的实验材料。若实验最终证实CDH-8是Cry5Ba在线虫体内的受体,将进一步丰富苏云金芽胞杆菌晶体蛋白杀线虫机制的研究,也将为植物寄生线虫的生物防治提供理论基础。