论文摘要
黄酮类化合物（flavonoids）是植物重要的一类次生代谢产物,具有多种药物活性,如抗心血管疾病、抗肿瘤、保护肝功等。但是由于天然黄酮类化合物大部分都是以结合型的糖苷形式存在,而大多研究证明,游离的苷元形式存在的黄酮化合物的药物活性要比结合型的糖苷形式高出许多,因此常通过去糖基定向修饰黄酮类化合物的分子结构以发挥其特定功能,其最常见最经济环保的修饰方法是通过酶法去掉糖基,而目前人们利用最多的酶为p-葡萄糖苷酶,但是大多数的β-葡萄糖苷酶对底物的糖基部分结构的专一性较差,因此如何提高其对黄酮类化合物的去糖基作用是现在研究的重点。嗜热菌海栖热袍菌Thermotoga maritima MSB8所产的p-葡萄糖苷酶（Tm-BglA）属于水解酶家族1,具有良好的热稳定性。在前期的实验工作中,发现它能够将黄酮化合物中的结合型糖苷转化为具有更高生物活性的游离型的黄酮化合物苷元,并且对于不同的黄酮化合物底物Tm-BglA表现出的专一性不一致。为了提高Tm-BglA对黄酮化合物的底物专一性,本课题将Tm-BglA与纤维四糖进行分子对接,预测Tm-BglA的苷元结合位点,并与九种来源于不同植物、微生物的同属水解酶家族1的p-葡萄糖苷酶的氨基酸序列进行多序列比对,将位于Tm-BglA蛋白结构中第五个p-折叠股上靠近苷元结合位点的三个氨基酸（F221,N223和G224）分别进行单点突变、双点突变和三突变,对Tm-BglA进行定向改造。主要通过反向PCR的方法将分别位于221位、223位和224位上的苯丙氨酸、天冬酰胺和甘氨酸分别替换成亮氨酸、亮氨酸和苏氨酸,以质粒pHsh作为载体,共构建了7个重组质粒,并转入大肠杆菌后进行纯化,比较这七个突变酶与野生型酶的酶学性质、动力学参数与黄酮化合物水解效率,分析这三个位点在Tm-BglA结构上、以及在水解黄酮化合物过程中的作用及影响,研究突变后各酶对黄酮化合物底物专一性的变化。本课题将成功构建的7个突变重组质粒转入到大肠杆菌宿主中进行表达纯化后,对其酶学性质、黄酮化合物的水解活性进行测定,与突变前的Tm-BglA进行比较,并结合分子对接对实验的结果进行分析讨论,结果表明221位、223位和224位这三个位置上的点突变不影响Tm-BglA的正常表达,对Tm-BglA的整体结构也未造成影响,没有引起Tm-BglA的最适条件、稳定性上的显著变化,但对于人工底物pNPG的动力学参数有较大影响。而点突变后,各酶对大豆异黄酮的水解活性与野生型酶相比均有不同程度的降低,对槲皮素糖苷水解活性也有不同的影响,其中含F221L点突变的突变酶与Tm-BglA相比较,对槲皮素-3,4’-O-葡萄糖和槲皮素-4’-O-葡萄糖的水解活性未发生改变,含N223L点突变的突变酶对槲皮素-3,4’-O-葡萄糖和槲皮素-4’-O-葡萄糖完全没有水解活性,而含G224T点突变的酶活性与Tm-BglA相比明显提高,含G224T点突变与Tm-BglA相比,对槲皮素-3,4’-O-葡萄糖的转化率提高了28.6%,对槲皮素-4’-O-葡萄糖的转化率提高了35%,分析其对槲皮素-4’-O-葡萄糖的动力学参数,表明Km值降低了24%,Vmax和Kcat分别提高了68%和140%。这说明三个氨基酸位点在Tm-BglA对黄酮化合物底物专一性中起着重要作用,其中点G224尤为突出。研究结果对研究p-葡萄糖苷酶的底物专一性提供重要的理论依据,对黄酮化合物的生物转化也具有重要应用价值。