论文摘要
毛细血管扩张性共济失调症（Ataxia telangiectasia,AT）是一种罕见的常染色体中单基因突变的隐性遗传病,其发生率为1:40,000～100,000,具有进行性小脑退化、高辐射敏感性、免疫缺陷、基因组不稳定性、年龄早熟和肿瘤高发病率等多种特殊的临床表现,尤其是高辐射敏感性已成为近年来放射生物学研究的热点之一。毛细血管扩张-共济失调症的临床表现与AT细胞中11q22-11q23染色体上的ATM （ataxia elangiectasia mutated,ATM）基因突变所导致的超重组、细胞周期调控异常、端粒缩短、高辐射敏感性等基因组不稳定性有关。ATM是DNA损伤信号传导通路中最早的传感和中枢调控基因。当电离辐射等诱导DNA损伤时,信号传导通路中的上游基因ATM能够感受DNA损伤信号,并通过催化Chk2（checkpoint kinase 2 ,Chk2）的磷酸化,实现对Chk2的调控,磷酸化后的Chk2进一步激活其下游的cdc25c,cdc25蛋白属磷酸酯酶,通过清除细胞周期调节蛋白p34cdc2蛋白Thr14和Tyr15的磷酸化维持p34cdc2的活性,实现对电离辐射诱导的DNA损伤的修复。因此,ATM对维持染色体的稳定性起重要作用。目的:研究毛细血管扩张性共济失调症（AT）患者皮肤的成纤维细胞系AT5BIVA（AT细胞）的应对电离辐射诱导细胞氧化损伤的能力;分析外源性ATM对辐射诱导的细胞周期变化的影响;探讨毛细血管扩张性共济失调突变基因（Ataxia telangiectasia mutation,ATM）介导的细胞周期检测点激酶2 （checkpoint kinase 2 ,Chk2）磷酸化及其下游细胞分裂周期蛋白Cdc25c（cell division cycle 25C,Cdc25c）在DNA损伤修复信号传导通路中作用机理。方法: （1）以源于正常人皮肤的成纤维细胞系GM063（GM细胞）为对照,采用超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）、丙二醛（Malondialdehyde, MDA）测定试剂盒,AT患者皮肤的纤维细胞系AT5BIVA（AT细胞）、GM细胞和ATM转染的AT细胞（AT-ATM+细胞）经60Coγ射线0、1、2、3、4Gy照射后,观察比较AT5BIVA、GM063和AT-ATM+细胞的SOD活性和MDA含量的差异,并分别进行曲线拟合（。2）采用流式细胞技术,AT细胞、GM细胞、ATM转染的AT细胞（AT-ATM+细胞）经60Coγ射线0、1、3、5、7Gy照射后,观察比较它们的细胞周期细胞比例变化情况的差异。（3）以GM细胞为对照,用免疫共沉淀与Western blot方法,观察60Coγ射线照射后AT细胞、GM细胞和AT-ATM+细胞的Chk2及Cdc25c蛋白表达的变化。经0、5、10、15Gy后,通过免疫共沉淀及Western Blot法分析三种细胞ATM和Chk2蛋白以及Chk2和Cdc25c蛋白之间的相互作用。结果:（1）在0、1、2、3、4Gy剂量照射下,AT细胞、GM细胞和AT-ATM+细胞中SOD活性均随受照剂量增加而明显降低（p<0.01）;同一剂量点的AT细胞中SOD活性明显低于GM细胞和AT-ATM+细胞（p<0.05）;AT细胞、GM细胞和AT-ATM+细胞中MDA含量均随受照剂量增加而升高（p<0.05）;同一剂量点的AT细胞中MDA含量明显高于GM细胞和AT-ATM+细胞（p<0.05）;AT细胞、GM细胞和AT-ATM+细胞的SOD活性和MDA含量均与照射剂量呈线性关系。（2）在1、3、5、7Gy剂量照射下,AT细胞G0/G1期、S期、G2/M期细胞比例变化不大;而GM细胞、AT-ATM+细胞G1期和G2期细胞比例均随受照剂量增加而上升,S期细胞比例均随受照剂量增加而降低。（3）0Gy照射时,AT细胞、GM细胞和AT-ATM+细胞均未出现Chk2蛋白表达条带,经60Coγ5、10、15Gy照射后,GM细胞、AT-ATM+细胞Chk2和Cdc25c蛋白均有表达;而AT细胞仅在15Gy照射后有弱表达。Chk2和Cdc25c蛋白之间存在着相互作用。结论:（1）由于AT细胞中SOD活性降低,导致AT细胞应对辐射的氧化损伤能力不足,引起AT细胞中MDA含量增加,是AT细胞高辐射敏感性的原因之一;（2）ATM在细胞遭受电离辐射后参与G1期、G2/M期阻滞修复DNA过程,AT细胞的细胞周期关卡缺失有关,可能是AT细胞高辐射敏感性的另一原因;（3）电离辐射照射后,Chk2由ATM介导磷酸化后可进一步与Cdc25c相互作用,这是信号通路传导过程中的一个级联反映,从而修复损伤的DNA,保持基因组的稳定性。
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标签：毛细血管扩张性共济失调症论文; 电离辐射论文; 超氧化物歧化酶论文; 丙二醛论文; 细胞周期论文;