人胚胎干细胞向造血细胞诱导分化的研究

论文摘要

血细胞输注和造血干细胞（hematopoietic stem cells ,HSCs）移植是细胞治疗的常用手段,可用来治疗恶性血液疾病、感染性疾病、遗传性疾病、重症免疫缺陷、AIDS等多种疾病。然而目前血细胞来源紧张及污染问题给其临床使用的安全性和广泛性带来了极大挑战。因此人们期望更为安全、有效和经济的血细胞资源。随着干细胞研究及其相关领域的生物学技术的快速发展,以人胚胎干细胞（human embryonic stem cells,hESCs）为启动细胞的造血干细胞工程为临床输血和干细胞的移植带来了新希望。目前,研究者主要使用造血发育相关因子或造血微环境的基质细胞促进人胚胎干细胞向造血细胞分化。虽然上述诱导方法在诱导胚胎干细胞向造血细胞分化上取得了良好的效果,但仍然存在着一些难以克服的局限性:鼠源饲养层是目前常用的较为高效的诱导方法;然而鼠源饲养层所带来的异源污染极大地限制了该研究的临床应用前景。诱导中使用的各种细胞因子多为基因工程产品,价格昂贵,可在研究中使用却不能大量推广。因此我们希望建立一种新的诱导方案既可以高效诱导人胚胎干细胞向造血细胞分化,又可以避免异源污染,同时可降低实验成本。造血发生经历3个阶段:卵黄囊造血、胎肝造血和骨髓造血。人卵黄囊造血时期为4～6周;胎肝造血时期为6～22周;骨髓造血从22周至出生。在胚胎发育的不同阶段,不同的造血微环境对造血发生发挥着重要作用。在利用ESCs体外定向分化为造血细胞的模型中,诱导条件（微环境）的选择策略是研究造血发生和分化调控机制的重要环节。胎肝是造血发育的主要位点,该组织的微环境为造血细胞的生成提供了必要的条件。理论上来说胎肝造血微环境对胚胎干细胞向造血细胞的分化应该会有很好的诱导支持作用。因此在本实验中我们模拟胎肝造血微环境,联合使用15周人胎肝基质细胞和人胎肝组织提取物诱导人胚胎干细胞分化为造血细胞,并比较该方法与人胎肝基质细胞诱导法及人胎肝基质细胞/细胞因子诱导法之间的差别,旨在建立一种高效安全的造血细胞诱导体系。首先,我们分离15周人流产胎儿胎肝基质细胞并制备胎肝组织细胞提取物,使用半定量RT-PCR和流式细胞技术分析了胎肝基质细胞表面标志及基因表达情况。结果表明人胎肝基质细胞表达间质细胞表面标志CD90、CD29,不表达造血细胞表面标志CD34和CD45;此外,人胎肝基质细胞表达造血发育支持因子EPO、Flt-3和SCF,但随着传代时间的延长这些因子的表达水平逐渐降低。由此我们选择前3代的胎肝基质细胞作为胚胎干细胞造血诱导的饲养层。之后,我们将人胚胎干细胞培养于低黏附性培养皿中诱导形成拟胚体（human embryoid bodies ,hEBs）,并用骨形成蛋白4（Bone morphogenetic proteins 4, BMP4）对拟胚体进行了处理,通过检测拟胚体向中胚层发育的情况,选择了适当培养天数的拟胚体,采用三种不同的诱导方法进行诱导分化。在诱导的过程中,我们收集不同培养天数的细胞,应用流式细胞技术检测了分化体系中CD34、CD45等造血表面抗原的表达情况,以确定各组的造血分化情况。结果表明三种不同的诱导方法均能促进人胚胎干细胞向造血细胞定向分化。但在不添加细胞因子和细胞提取物的情况下,胎肝基质细胞诱导人胚胎干细胞向造血细胞分化的能力较弱,在诱导的10天中CD34+细胞比率与CD45+细胞比率均低于10%。在添加细胞因子之后,人胚胎干细胞向造血细胞分化的能力明显增强,其中CD34+细胞最高可达24.68%, CD45+细胞最高可达13.57%。联合使用胎肝基质细胞与胎肝细胞提取物则能更为高效的诱导人胚胎干向造血细胞发育,其中CD34+细胞最高可达32.73%, CD45+细胞最高可达27.96%。此外,我们收集诱导10天的细胞,应用RT-PCR检测了细胞造血相关基因的表达变化情况;应用克隆形成实验检测了细胞的造血克隆形成能力;应用Wright—Giemsa染色观测了细胞的形态;应用免疫荧光染色技术检测了诱导集落造血表面抗原的表达情况。结果发现,诱导产生的细胞具有造血细胞的一般特性,表达造血相关基因AML、SCL、GATA-1;在半固体培养基中可分化为不同种类的造血克隆。但不同诱导体系中产生的细胞造血基因的表达量与造血克隆的生成能力不同,胎肝基质细胞/胎肝细胞提取物体系产生细胞AML、SCL、GATA-1的表达量及形成的造血克隆最多,且以红系克隆为主。在上述研究的基础上,我们进一步探讨造血祖细胞向红系发育的机制,并建立了高效的造血祖细胞向红细胞的分化体系,为以胚胎干细胞为启动细胞诱导分化规模化的产生红细胞奠定一定的基础。红细胞的产生受到造血因子和造血干细胞自身内在基因的共同调控,其中促红细胞生成素（erythropoietin,EPO）是其产生的最重要因子。细胞因子信号转导抑制因子-3（suppressor of cytokine signaling-3 ,SOCS-3）最早发现于1997年,有研究证明EPO受体上有SOCS-3的高亲和结合位点,SOCS-3对EPO具有负调控作用。因此,我们推测降低胚胎干细胞或造血祖细胞中SOCS-3基因的表达水平有利于它们向红系的发育。在本实验中我们选择具有造血干细胞特性的人红白血病细胞株K562作为研究对象,构建了SOCS-3慢病毒siRNA干涉载体,转染K562细胞。根据绿色荧光蛋白的表达进行流式分选后,我们获得了高表达慢病毒干涉载体的细胞。实时荧光定量PCR和Western-blot检测了转染细胞中SOCS-3基因的干涉效率,结果显示与对照组相比,siRNA干涉后K562细胞SOCS-3基因的表达量仅为其相对表达量的22.1%,干涉效率77.9%;Western -blot结果显示SOCS-3在蛋白质水平表达也明显受抑制。我们进一步对SOCS-3基因沉默后的K562细胞进行了诱导分化,并采用联苯胺染色法检测K562细胞向红系分化比例变化,免疫荧光染色检测细胞表面抗原的变化,RT-PCR检测造血相关基因的变化,发现SOCS-3沉默后K562细胞向红系的发育能力显著提高。综上所述,在本研究中我们采用三种不同方法诱导人胚胎干细胞分化为造血细胞,并证明联合使用胎肝基质细胞和胎肝组织细胞提取物是较好的诱导方法,该方法可高效诱导胚胎干细胞向造血细胞分化,且避免了鼠源饲养层所带来的异源污染,降低了实验成本。在此基础上我们通过构建慢病毒干涉载体的方法,稳定干涉了K562细胞中SOCS-3表达,建立了高效的造血祖细胞向红系细胞诱导体系,证明了SOCS-3基因沉默有利于造血祖细胞向红系的发育。上述研究为深入探讨造血细胞发育调控机制以及以胚胎干细胞或造血干细胞为启动细胞大规模的诱导产生红细胞体系的建立奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩略词
• 前言
• 一.胚胎干细胞的特性
• 二.胚胎干细胞的定向诱导分化
• 三.胚胎干细胞分化的调控
• 四.胚胎干细胞的造血细胞分化的研究进展
• 五.SOCS-3 对红系发育的影响
• 六.本实验的研究方法与目的
• 主要实验设备
• 主要试剂
• 第一部分 人胚胎干细胞向造血细胞定向诱导分化
• 前言
• 实验流程
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分 SiRNA 沉默soc53 对红系发育的影响
• 前言
• 实验设计
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 总结
• 参考文献
• 个人简介
• 致谢