HCV核心蛋白单克隆抗体制备及其与载脂蛋白A1、转位蛋白相互作用

论文摘要

目的:本实验构建丙型肝炎核心蛋白（HCV core）原核表达载体,在大肠埃希菌中进行表达、并纯化融合蛋白;制备抗core蛋白单克隆抗体并进行鉴定。研究HCVcore在肝源性细胞系中与载脂蛋白AⅠ（apoAⅠ）、转位蛋白（Translin）相互作用,为丙型肝炎病毒引起的脂肪肝和肝癌的分子机制提供理论基础。方法:构建原核表达载体pET-32a（+）HCV-core,转化大肠埃希菌BL21中,以IPTG诱导获得core融合蛋白。利用Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化及上柱复性。用纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合,获得抗HCV-core蛋白的单克隆抗体。利用Western blot、ELISA法和免疫组化对单克隆抗体进行特异性和灵敏度分析及鉴定。构建真核表达质粒:pDNA3.1-myc-his-apoAⅠ、pDNA3.1-myc-his-Translin、pDNA3.1（-）core、pact-apoAⅠ、pact-Translin和pBIND-core,共转染到HepG2细胞中。用免疫共沉淀（CoIP）和哺乳动物双杂交的方法,Westren blot分析免疫共沉淀杂交带,用Dual Luciferase Reporter AssaySystem检测荧光素酶强度。结果:1:HCV核心蛋白基因PCR产物及连接到pET32a（+）中,经双酶切和DNA测序鉴定,成功构建pET-32a（+）-core,HCV-core融合蛋白表达成功。通过Ni+亲和柱对表达蛋白进行纯化,获得core蛋白（42KD）。用纯化蛋白常规免疫BALB/c小鼠,并鼠尾静脉取血。用ELISA检测免疫后小鼠血清出现抗core抗体,并且血清抗体滴度成逐渐增高趋势。Western blot证明血清抗体能检测到HCV肝硬化患者肝组织中core蛋白,进一步证明我们制备的core融合蛋白与天然存在的core蛋白结构基本一致。用脾细胞与骨髓瘤细胞融合,细胞融合率59.2%。用ELISA和Westren blot筛选单克隆抗体株阳性率6.3%。有限稀释再次筛选共获得稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株。用ELISA测定其效价,上清效价最高的细胞株是4E10。以4E10细胞上清作为一抗,Western blot检测纯化抗原可检测到8ng的抗原;免疫组织化学发现:在HCV肝癌组织中,HCVcore主要位于肝细胞胞浆中,呈灶性或弥漫性分布。2:共转染pDNA3.1-myc-his apoAⅠ和pDNA3.1（-）HCVcore进入HepG2细胞中,经免疫共沉后Western blot结果显示:单独core蛋白的杂交带相对分子量大概19kDa,共沉淀带相对分子量大约50kDa。所构建的真核载体能在HepG2细胞中表达,并且HCVcore和apoA1二种蛋白能相互结合。而且也用pDNA3.1-myc-hisapoAⅠ和pDNA3.1（-）HCVcore单独转染入HepG2细胞中,每种质粒都能在细胞中过表达,且不与HepG2细胞内其它蛋白结合。pACT-apoAⅠ和pBIND-core共转染时,相对荧光素酶活性值较pACT和pBIND空载体转染组以及pACT-apoA1和pBIND空载体、pACT空载体和pBIND-core转染组明显升高（12～16倍）。表明HCVcore和apoAⅠ在体内能相互结合,且单独转染后没有自身激活作用。3:共转染pDNA3.1-myc-his Translin和pDNA3.1（-）HCVcore进入HepG2细胞中,经免疫共沉后Western blot结果显示:单独core蛋白的杂交带相对分子量大概19kDa,共沉淀带只出现Translin蛋白杂交带相对分子量大约21.8kDa。pACT-Translin和pBIND-core共转染时,相对荧光素酶活性值较其他组明显升高（6～8倍）。表明HCVcore和Translin在体内能相互结合。结论:成功表达、纯化HCV-core基因融合蛋白,获得高特异性、高效价鼠抗HCV-core单克隆抗体,为研究core基因的生物学功能提供了新的手段。HCV-core可与apoAⅠ、Translin在体内相互作用,为慢性丙型肝炎致肝脂肪变和肝癌的机制的研究提供理论依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 注释说明清单
• 引言
• 1 HCV核心蛋白单克隆抗体的制备
• 1.1 HCV核心蛋白的构建及其纯化
• 1.1.1 材料和方法
• 1.1.2 结果
• 1.2 HCV核心蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
• 1.2.1 材料和方法
• 1.2.2 结果
• 1.3 讨论
• 2 HCV核心蛋白与载脂蛋白AⅠ的相互作用
• 2.1 研究背景
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 3 HCV核心蛋白与转位蛋白的相互作用
• 3.1 材料与方法见第二部分
• 3.2 结果
• 3.3 讨论
• 结论与展望
• 参考文献
• 后记或致谢
• 作者简介及读研期间主要科研成果