梅花鹿茸干细胞S100A4基因的克隆、表达及功能分析

论文摘要

鹿茸作为哺乳动物唯一能够完全再生的附属器官,为我们提供了一个难得的生物医学模型。生茸骨膜（Antlerogenic Periosteum,AP）组织是鹿茸发育和再生的发起点,角柄骨膜（Pedicle Periosteum,PP）是鹿茸再生的关键组织,通过对这两种组织细胞的研究,来揭示鹿茸生长调控机制。S100A4蛋白是一种肿瘤相关因子,与细胞凋亡,细胞转移以及血管形成等有关。S100A4蛋白在两种骨膜细胞之间差异表达是本文的切入点。为了研究S100A4基因在鹿茸发育和再生过程中的作用,培养了梅花鹿生茸骨膜细胞,提取总RNA并以Oligo dT为引物反转录成cDNA。根据牛的S100A4基因序列（GI:31341581）设计引物,克隆了梅花鹿的S100A4基因,并对其序列进行了分析。将S100A4基因序列与表达载体pLEGFP-C1重组,重组载体pLEGFP-S100与被膜载体pVSV-G共转染包装细胞GP2-293,获得含有S100A4基因的复制缺陷型病毒液,感染角柄骨膜细胞,将可以自主表达的S100A4基因导入角柄骨膜细胞,用G418筛选被感染的细胞,获得稳定表达S100A4融合蛋白的细胞系。通过RT-PCR在转录水平检测S100A4基因的表达情况,利用鸡胚尿囊绒毛膜实验分析S100A4蛋白在鹿茸发育中的作用。本试验首次克隆了梅花鹿S100A4基因,并构建了pLEGFP-S100重组载体,筛选获得了稳定表达S100A4融合蛋白的角柄骨膜细胞系。利用鸡胚模型探测到S100A4蛋白与血管形成有密切的关系,为进一步揭示鹿茸发育机理及生长调控机制奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 英文缩写一览表
• 第1章 绪论
• 1.1 鹿茸的发育
• 1.1.1 再生的过程
• 1.1.2 再生过程中的形态结构和组织发生
• 1.1.3 鹿茸生长的调控机制
• 1.2 鹿茸研究的意义
• 1.3 S100A4 的研究进展
• 1.3.1 S100A4 抑制细胞凋亡
• 1.3.2 S100A4 与细胞转移
• 1.3.3 S100A4 促进血管形成
• 1.3.4 S100A4 在鹿茸发育过程中的研究
• 1.4 本文的主要研究内容
• 第2章 梅花鹿S100A4 基因的克隆与分析
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 主要试剂
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 梅花鹿 AP 细胞取材与培养
• 2.2.4 提取AP 细胞总RNA
• 2.2.5 反转录获得基因片段
• 2.2.6 PCR 产物回收
• 2.2.7 制备感受态大肠杆菌
• 2.2.8 目的片段克隆T 载体
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 AP 细胞原代培养结果
• 2.3.2 S100A4 基因扩增
• 2.3.4 序列分析
• 2.4 本章小结
• 第3章 重组质粒构建
• 3.1 引言
• 3.2 主要材料与试剂
• 3.2.1 逆转录病毒表达系统
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.3 方法步骤
• 3.3.1 质粒提取
• 3.3.2 双酶切pLEGFP-C1 和T 载体
• 3.3.3 连接转化
• 3.3.4 重组质粒鉴定
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 T 载体双酶切结果
• 3.4.2 重组质粒鉴定结果
• 3.5 本章小结
• 第4章 重组病毒的制备
• 4.1 引言
• 4.2 材料与仪器
• 4.2.1 主要试剂材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 实验步骤
• 4.3.1 大量提取pVSV-G 及pLEGFP-S100 质粒
• 4.3.2 病毒的包装
• 4.3.3 病毒滴度测定
• 4.4 结果与讨论
• 4.5 本章小结
• 第5章 感染细胞的筛选及鉴定
• 5.1 引言
• 5.2 材料与仪器
• 5.2.1 主要试剂
• 5.2.2 主要仪器
• 5.3 实验步骤
• 5.3.1 PP 细胞对G418 耐受性
• 5.3.2 感染PP 细胞
• 5.3.3 RT-PCR 检测
• 5.3.4 鸡胚尿囊绒毛膜（CAM）实验
• 5.4 结果与讨论
• 5.4.1 G418 筛选结果
• 5.4.2 PP 细胞感染结果
• 5.4.3 RT-PCR 检测
• 5.4.4 CAM 实验
• 5.5 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 附录1：试剂配方
• 附录2：测序结果
• 攻读硕士学位期间发表的论文
• 致谢
• 详细摘要