论文摘要
早期生长反应基因-1（early growth response gene 1, Egr-1）是即早基因家族的一员,能在众多刺激因素的作用下快速表达,介导细胞对外界环境改变的反应。缺氧或缺血可诱导Egr-1表达,进而引起其下游靶基因与凝血、炎症反应等相关因子的迅速表达,从而在心脏缺血再灌注（ischemia/reperfusion, I/R）损伤中起到了中心性的作用。目前认为,炎性反应、凝血和血管高通透性是I/R所致心肌损伤的中心环节,在此过程中,内皮细胞功能紊乱是I/R损伤发生的始动环节。内皮细胞缺氧损伤后诱导Egr-1表达增高而促进炎症因子的释放,进而引起白细胞聚集粘附、血管收缩、血栓形成及内皮细胞肿胀造成无复流现象,加重I/R损伤。碘化N-正丁基氟哌啶醇（N-n-butyl haloperidol iodide, F2）是我课题组合成一个新化合物,在探讨其拮抗心肌I/R损伤新机制的过程中发现,F2可明显抑制I/R心肌组织或缺氧复氧（Hypoxia and Reoxygenation, H/R）心肌细胞中Egr-1基因及蛋白表达水平的升高,改善心肌功能,表明F2抗I/R损伤的作用与其对Egr-1基因和蛋白表达的抑制作用密切相关。本实验选取I/R损伤最先受累的内皮细胞作为研究对象,采用培养的心脏微血管内皮细胞H/R模型,观察F2对H/R所致内皮细胞损伤及Egr-1基因及蛋白表达以及炎症反应的影响,进一步探讨F2拮抗心肌I/R损伤的作用机制。方法1.进行大鼠心脏微血管内皮细胞（以下简称内皮细胞）原代培养及鉴定:倒置相差显微镜下观察培养内皮细胞形态结构,采用免疫细胞化学方法,对内皮细胞进行鉴定。2.缺氧复氧模型的建立:培养的内皮细胞换用被高纯氮气饱和的缺氧液,置于密闭且充满氮气的缺氧箱中,37℃缺氧3 h,后又在正常培养条件下培养2 h,造成H/R损伤。3.实验分组:取3-5代的内皮细胞随机分为五组:正常对照组（Control）、缺氧复氧组（H/R）、溶剂组（聚乙二醇400,PEG）、F2组和阳性对照药（维拉帕米,Verapamil, VER）组。F2组、VER组、PEG组于缺氧液及复氧液中分别给予F2（1×10-6 mol/L）、VER（1 mg/L）及等容积的PEG。Control组除外,其余各组均作H/R模型。4. RT-PCR法检测培养内皮细胞中Egr-1 mRNA的表达水平。5. Western-blot法及免疫细胞化学法检测培养内皮细胞中Egr-1蛋白的表达水平及观察其亚细胞定位。6. ELISA法测定细胞培养上清液中肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）、白细胞介素-1β（interleukin-1 beta, IL-1β）、白细胞介素-6（ interleukin-6, IL-6 ）、细胞间粘附分子-1 （ intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1）的含量,以反映内皮细胞炎症程度。7.用比色法测定髓过氧化酶（MPO）活性反映中性粒细胞粘附程度。8.扫描电子显微镜（SEM）下观察内皮细胞同血小板的相互作用。9.用比色法测定细胞培养上清液中乳酸脱氢酶（LDH）的活性,用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）的含量,黄嘌呤氧化酶法测定内皮细胞中超氧化物歧化酶（SOD）的活性,以反映内皮细胞损伤的程度。结果一、大鼠心脏微血管内皮细胞培养经差速贴壁纯化后的细胞用免疫细胞化学鉴定,Ⅷ因子样物质阳性细胞达97 %以上,在内皮细胞生长因子的培养基培养下生长较迅速,常规液氮冻存和复苏可维持良好的生长状况,表明分离培养后的细胞是内皮细胞。二、F2对缺氧复氧心脏微血管内皮细胞Egr-1表达的影响1. RT-PCR实验结果显示:与Control组相比,H/R组及PEG组内皮细胞中Egr-1 mRNA表达明显增高,但H/R组及PEG组之间的表达无明显差异。F2组和VER组Egr-1 mRNA的表达较I/R组明显下调。2. Western-blot实验结果显示:与Control组相比,H/R组及PEG组内皮细胞中Egr-1蛋白表达明显增强,但H/R组及PEG组之间的表达无明显差异。F2组和VER组Egr-1蛋白的表达较H/R组明显下调。3.免疫组织化学结果表明,Control组仅见个别内皮细胞胞核Egr-1蛋白弱阳性表达。H/R、PEG组内皮细胞Egr-1蛋白均有较强表达,且强阳性表达主要见于细胞胞核中;而F2组及VER组中Egr-1蛋白表达的程度均明显减弱。三、F2对缺氧复氧心脏微血管内皮细胞炎症反应的影响1. F2对培养内皮细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1分泌的影响: H/R组及PEG组培养上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1含量较Control组显著增高;而在缺氧液及复氧液中加入F2或VER则能明显抑制H/R所致内皮细胞TNF-α、IL-1β、IL-6和ICAM-1的分泌。2. F2对培养内皮细胞与中性粒细胞粘附的影响:MPO活性测定结果显示,与Control组相比,H/R组及PEG组内皮细胞MPO活性明显增高;F2组和VER组MPO活性较H/R组明显降低。3. F2对培养内皮细胞同血小板相互作用的影响:SEM结果显示,与Control组相比,H/R组及PEG组内皮细胞表面聚集的血小板明显增多; F2组和VER组Egr-1血小板的聚集较H/R组明显减少。四、F2对缺氧复氧心脏微血管内皮细胞损伤的影响1. F2对培养内皮细胞上清液中LDH含量的影响:与Control组相比,H/R组及PEG组培养上清液中LDH含量显著增高（P <0.05）。F2组和VER组LDH含量明显降低（P <0.05）。2. F2对培养内皮细胞SOD活力及MDA含量的影响:与Control组相比,H/R组及PEG组SOD活力显著降低,MDA含量显著增高,而在应用F2和VER以后,内皮细胞SOD活力明显升高（P <0.05）,MDA含量明显降低（P <0.05）。结论1. H/R引起内皮细胞Egr-1 mRNA及蛋白的异常表达,进而引发细胞损伤、炎症反应。2. F2可以抑制H/R所致内皮细胞Egr-1 mRNA及蛋白的异常表达,进而减轻内皮细胞H/R损伤、抑制炎症反应,保护内皮细胞,这可能是其抗心肌缺血再灌注损伤作用的机制之一。3.内皮细胞是F2作用的主要靶细胞之一。
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标签：碘化正丁基氟哌啶醇论文; 早期生长反应基因论文; 心脏微血管内皮细胞论文; 缺氧复氧论文;