6-羟基-8-氯辛酸乙酯的非水相酶促拆分

论文摘要

α-硫辛酸是广泛存在于动植物体内的强抗氧化剂,已经在医药、生物食品、营养品、化妆品等领域广泛应用。由于（S）-α-硫辛酸几乎不具有抗氧化活力,因此获得光学纯的（R）-α-硫辛酸受到广泛关注。目前生物合成方法主要有酯酶催化水解拆分和不对称生物还原等途径。本课题通过非水介质系统中的酶促乙酰化反应动力学拆分混旋6-羟基-8-氯辛酸乙酯获取（R）-对映体,以期与其主要工业合成途径（己二酸途径）相耦合,从而最终合成具有高抗氧化活性的右旋体（R）-α-硫辛酸。本课题针对目标底物6-羟基-8-氯辛酸乙酯筛选了对其具有较高活性和选择性的商品脂肪酶Novozym 435,测定了其动力学参数和反应活化能,并分别从酰化剂、温度、反应介质、水活度、底物耐受性和催化剂上载量等方面系统地优化了该酶促乙酰化反应的各项参数。在优化条件下,反应6h后底物转化率达到47%,产物对映体过量值（ee）为90%,时空产率为471 g·L-1·d-1。但是发现反应中Novozym 435失活明显,无法实现重复批次式操作。研究Novozym 435失活的因素发现：温度、酰化剂和底物对固定化酶Novozym 435的稳定性影响较大。在重新优化了部分反应条件后,Novozym 435的稳定性得到了显著提高,在10批次重复操作反应中保持了较好的催化活力和选择性,控制每一批次的转化率在40%,产物对映体过量值维持在92-96%。在优化条件下,对该反应产物进行了克级制备：反应3.5 h后,转化率达到42%,eep为94%,时空产率为38g·L-1·d-1；通过柱层析分离,共获得（R）-6-乙酰氧基-8-氯辛酸乙酯4.89 g,产率为35%（以消旋底物为基准）。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 文献综述
• 1.1 手性药物
• 1.2 硫辛酸简介
• 1.3 硫辛酸的功能及应用
• 1.4 硫辛酸的国内外生产企业及生产路线和规模
• 1.5 α-硫辛酸的化学合成方法
• 1.5.1 己二酸及其衍生物合成法
• 1.5.2 环己酮及其衍生物合成法
• 1.5.3 其他化学合成方法
• 1.5.4 常用化学方法比较
• 1.6 （R）-α-硫辛酸的生物合成法
• 1.6.1 酯酶/脂肪酶催化拆分法
• 1.6.2 不对称还原法
• 1.6.3 常用（R）-α-硫辛酸生物合成的方法比较
• 1.7 有机介质中的生物催化反应
• 1.7.1 有机溶剂中酶的催化活力
• 1.7.2 有机溶剂中酶的稳定性
• 1.7.3 有机介质中的酶促乙酰化反应
• 1.8 本课题的研究目的及意义
• 1.9 本论文的主要研究内容
• 第2章 催化剂的筛选
• 2.1 引言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 化学试剂和酶
• 2.2.2 仪器
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 乙酰化方法
• 2.3.2 底物6-羟基-8-氯辛酸乙酯的纯化
• 2.3.3 6-乙酰氧基-8-氯辛酸乙酯的制备（分析用标样）
• 2.3.4 重组菌脂肪酶的表达及制备
• 2.3.5 催化剂的初筛
• 2.3.6 催化剂的复筛
• 2.3.7 分析方法
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 底物6-羟基-8-氯辛酸乙酯的纯化
• 2.4.2 6-乙酰氧基-8-氯辛酸乙酯的化学法合成（分析用标样）
• 2.4.3 初筛
• 2.4.4 复筛
• 2.5 本章总结
• 第3章 6-羟基-8-氯辛酸乙酯酶促拆分过程优化
• 3.1 引言
• 3.2 实验材料
• 3.2.1 化学试剂和酶
• 3.2.2 仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 酰基供体的选择
• 3.3.2 动力学参数的测定
• 3.3.3 温度对酶促乙酰化反应的影响
• 3.3.4 反应介质对酶促乙酰化反应的影响
• 3.3.5 底物和酰化剂加入比例的优化
• 3.3.6 水活度对6-羟基-8-氯辛酸乙酯乙酰化反应的影响
• 3.3.7 Novozym 435的上载量对乙酰化反应的影响
• 3.3.8 CALB游离酶粉的制备
• 3.3.9 6-羟基-8-氯辛酸乙酯浓度标准曲线的绘制
• 3.3.10 6-乙酰氧基-8-氯辛酸乙酯浓度标准曲线的绘制
• 3.3.11 Novozym 435对底物和产物吸附量的测定
• 3.3.12 Novozym 435的底物耐受性考察
• 3.3.13 （R）-6-乙酰氧基-8-氯辛酸乙酯的克级制备
• 3.3.14 固定化酶Novozym 435的操作稳定性
• 3.4 结果与讨论
• 3.4.1 酰基供体的选择
• 3.4.2 动力学参数的测定
• 3.4.3 反应温度优化和反应活化能
• 3.4.4 最适反应介质的选取
• 3.4.5 反应体系水活度的优化
• 3.4.6 Novozym 435上载量的优化
• 3.4.7 Novozym 435吸附底物和产物的研究
• 3.4.8 Novozym 435的底物耐受性考察
• 3.4.9 （R）-6-乙酰氧基-8-氯辛酸乙酯的克级制备
• 3.4.10 固定化酶Novozym 435的操作稳定性
• 3.5 本章总结
• 第4章 Novozym 435失活机理的探讨
• 4.1 引言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 化学试剂和酶
• 4.2.2 仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 6-乙酰氧基-8-氯辛酸乙酯浓度标准曲线的绘制
• 4.3.2 Novozym 435酶活的测定方法
• 4.3.3 温度对Novozym 435稳定性的影响
• 4.3.4 有机溶剂对Novozym 435稳定性的影响
• 4.3.5 底物浓度对Novozym 435稳定性的影响
• 4.3.6 酰化剂对酶活力和稳定性的影响
• 4.3.7 反应介质对酶活力和稳定性的影响
• 4.3.8 温度对酶活力和稳定性的影响
• 4.3.9 Novozym 435上载量对酶催化活力的影响
• 4.3.10 固定化酶Novozym 435的操作稳定性
• 4.3.11 （R）-6-乙酰氧基-8-氯辛酸乙酯的克级制备
• 4.3.12 产物旋光度的测定
• 4.4 实验结果
• 4.4.1 温度对Novozym 435稳定性的影响
• 4.4.2 有机溶剂对Novozym 435稳定性的影响
• 4.4.3 底物6-羟基-8-氯辛酸乙酯对Novozym 435稳定性的影响
• 4.4.4 酰化剂对酶活力和稳定性的影响
• 4.4.5 有机溶剂对酶活力和稳定性的影响
• 4.4.6 温度对酶活力和稳定性的影响
• 4.4.7 Novozym 435上载量对乙酰化反应初速度的影响及单位酶量生产率的考察
• 4.4.8 固定化酶Novo-m 435的操作稳定性
• 4.4.9 （R）-6-乙酰氧基-8-氯辛酸乙酯的克级制备
• 4.5 本章总结
• 第5章 总结与展望
• 参考文献
• 附录
• 攻读硕士期间撰写的论文
• 致谢