棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆及功能研究

论文摘要

本文利用PVX病毒载体建立棉疫病菌（Phytophthora boehmeriae）的cDNA文库，采用功能筛选策略克隆了能诱导烟草产生过敏反应的激发子基因（片段）。以农杆菌Mog101为宿主、利用PVX病毒表达载体构建了含有6800个单克隆的棉疫病菌cDNA，采用牙签接种本氏烟（Nicotiana benthamiana），从4100个克隆中筛选到12个能引起烟草过敏反应的阳性克隆。对上述阳性克隆进行序列测定和分析，发现其中7个与已知的基因具有较高的同源性，其中克隆PBC43编码一个特异的elicitin蛋白；克隆PBC163编码一个Rab蛋白，与大豆疫霉的RAB基因同源性较高；克隆PBC241编码prohibitin蛋白；PBN62编码一个热激蛋白60（HSP60）。还有5个克隆在公共数据库中没有同源基因，提示可能是该病原菌特异的激发子基因。上述结果表明，利用病毒表达载体建立cDNA文库采用功能筛选策略可从棉疫病菌全基因组范围内筛选诱导烟草产生HR的激发子基因，该方法可望为其它植物病原菌激发子基因的克隆提供技术平台。 从棉疫病菌（Phytophthora boehmeriae）cDNA文库中筛选到一个能引起烟草过敏反应的elicitin基因，命名为Pbelicitin（Phytophthora boehmeriae elicitin）。经southern杂交分析表明，该基因在基因组中至少有5个拷贝。该基因的原核表达产物能诱导野生型烟草Xanthi和不能积累乙烯的Tetre烟草产生过敏反应和对TMV与Phytophthora nicotianae产生系统获得抗性，且能诱导这两种烟草的PR-1a、PR-1b和PR-1c基因的表达，表明Pbelicitin诱导的HR和SAR受不依赖于乙烯的信号途径控制；而该原核融合表达产物只能诱导不能积累水杨酸的转nahG基因烟草NahG产生过敏反应，不能诱导其PR-1a、PR-1b和PR-1c的表达，表明SA不参与该elicitin诱导的HR，而参与其诱导的系统获得抗病性。并且在棉疫病菌与棉花亲和互作中Pbelicitin下调表达的。 从棉疫病菌（Phytophthora boehmeriae）cDNA文库中筛选到一个能引起烟草过敏反应的RAB基因片段，根据公共数据库序列比对后，根据同源序列设计引物，扩增出了该基因的长度为606bp的全长序列，命名为PbRAB。经southern杂交分析表明，该基因在基因组中是单拷贝的。PbRAB基因的原核表达产物处理野生型烟草Xanthi后，发现能够作为效应因子引起烟草的HR反应和H2O2的积累，通过RT-PCR分析表明经处理的烟草在过敏性坏死反应过程中有PR基因的诱导表达。本试验还构建了四个功能突变体，初步分析了引起过敏性坏死反应的功能区域，并确认了基因原核表达产物发挥

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• 中文摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 上篇
• 文献综述
• 第一章 植物对病原菌的非寄主抗性
• 1 已知非寄主抗性组成
• 1.1 预存性的或被动的防卫机制
• 1.2 诱导的植物防卫机制
• 1.3 植物防卫信号
• 1.4 抗病基因
• 2 非寄主抗性的类型
• 2.1 Ⅰ型非寄主抗性
• 2.2 Ⅱ型非寄主抗性
• 3 非寄主抗性与基因对基因抗性的相似之处
• 4 讨论与展望
• 参考文献
• 第二章 植物病原菌激发子及其和植物互作机制研究
• 一、植物病原菌激发子的种类和性质
• 1 生物激发子
• 1.1 寡糖
• 1.2 糖蛋白
• 1.3 多肽和蛋白质
• 2 非生物激发子和物理刺激因子
• 二、激发子诱导植物抗病性机制
• 1 激发子信号识别和信号传导
• 1.1 信号识别（signal recognition）
• 1.2 信号传导（signal transduction）
• 2 防卫基因的表达调控及抗病反应
• 三、疫霉菌激发子基因的克隆
• 四、棉疫病菌与非寄主植物研究
• 参考文献
• 下篇
• 研究内容
• 第一章 棉疫病菌诱导非寄主过敏反应激发子基因的克隆
• 1.材料和方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 供试药剂和培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 棉疫病菌培养
• 1.2.2 菌丝体RNA的提取（TRIzol法）
• 1.2.3 cDNA文库的构建
• 1.3 电转化方法
• 1.3.1 电转化感受态细菌的制备
• 1.3.2 电击穿孔转化
• 1.4 质粒提取方法
• 1.5 PCR验证阳性克隆
• 1.6 农杆菌感受态细胞的制备和转化方法
• 1.6.1 农杆菌感受态细胞的制备
• 1.6.2 农杆菌感受态细胞的转化方法
• 1.7 诱导烟草过敏反应激发子基因克隆的筛选
• 1.8 阳性克隆的测序和序列分析
• 2 结果
• 2.1 cDNA表达文库的构建
• 2.2 诱导烟草过敏反应的激发子基因阳性克隆筛选
• 2.3 序列比对及生物信息学分析
• 3 讨论
• 参考文献
• 第二章 棉疫病菌elicitin基因功能研究
• 1.材料和方法
• 1.1 供试棉疫病菌菌株
• 1.2 基因组DNA的提取方法
• 1.3 Southern杂交分析
• 1.4 大肠杆菌JM109、BL21感受态细胞的制备
• 1.5 elicitin基因原核表达
• 1.6 供试烟草及激发子处理
• 1.7 诱导系统抗病性分析
• 1.8 烟草PR基因表达分析方法
• 1.9 棉疫病菌与棉花亲和互作中Pbelicitin基因的表达情况
• 2 结果
• 2.1 棉疫病菌elicitin基因的序列分析
• 2.2 Pbelicitin原核表达的生物活性
• 2.3 Pbelicitin原核表达产物诱导抗性
• 2.4 水杨酸参与Pbelicitin的诱导抗性而不参与其诱导过敏反应
• 2.5 乙烯不参与Pbelicitin的诱导抗性和过敏反应
• 2.6 Pbelicitin基因在亲和性互作中的表达情况
• 3 讨论
• 参考文献
• 第三章 棉疫病菌RAB基因功能研究
• 1 材料和方法
• 1.1 供试棉疫病菌菌株和烟草
• 1.2 棉疫病菌菌株DNA和RNA的提取方法
• 1.3 棉疫病菌PbRAB基因的克隆及序列分析
• 1.4 Southern杂交分析方法
• 1.5 大肠杆菌JM109、BL21感受态细胞的制备
• 1.6 PbRAB基因原核表达
• 2O₂的原位测定'>1.7 H₂O₂的原位测定
• 1.8 烟草PR基因表达分析方法
• 1.9 RAB基因的功能域研究
• 1.10 突变体RABⅠ,RABⅡ,RABⅢ,RABⅣ功能分析
• 2 结果
• 2.1 棉疫病菌Rab基因克隆与序列分析
• 2.2 RAB基因的Southern杂交分析
• 2O₂积累和坏死反应'>2.3 RAB基因原核表达蛋白引起烟草H₂O₂积累和坏死反应
• 2.4 RAB基因原核表达蛋白注射烟草引起烟草PR1基因的表达
• 2.5 RAB基因的功能域研究
• 3 讨论
• 参考文献
• 2O₂介导PB90诱导的不结球白菜细胞死亡和防卫反应'>第四章 H₂O₂介导PB90诱导的不结球白菜细胞死亡和防卫反应
• 1.材料与方法
• 1.1 供试植物与菌株及接种
• 2O₂的测定'>1.2 H₂O₂的测定
• 1.3 PAL活性测定
• 1.4 脂质过氧化测定
• 1.5 电镜分析
• 2O₂的原位测定'>1.6 H₂O₂的原位测定
• 1.7 细胞死亡测定
• 1.8 离子渗漏测定
• 1.9 PR基因表达分析
• 2 结果
• 2.1 PB90诱导不结球白菜程序性细胞死亡
• 2O₂的进发'>2.2 PB90诱导不结球白菜H₂O₂的进发
• 2O₂动态平衡的改变先于PCD'>2.3 PB90诱导的H₂O₂动态平衡的改变先于PCD
• 2.4 PB90处理后PR-1和chitinase表达
• 2.5 PB90诱导不结球白菜对C. higginsianum和E. carotovora var. carotovora的抗性
• 2.6 激发子PB90诱导PAL和MDA活性提高
• 2.7 抗氧化剂和DPI抑制PR-1和Chitinase基因的表达
• 3 讨论
• 参考文献
• 博士期间发表的论文
• 致谢