珊瑚共附生可培养真菌菌群多样性及其生物活性研究

论文摘要

本文从广东徐闻珊瑚礁国家级自然保护区采集8种珊瑚,用培养法分离纯化真菌,应用形态学观察与分子鉴定相结合的方法,进行珊瑚共附生真菌菌群多样性研究,并对分离的真菌菌株进行生物活性筛选。运用稀释平板法和基于internal transcribed spacer-rDNA （ITS-rDNA）基因序列的系统发育分析对珊瑚共附生可培养真菌多样性进行研究,将所得到的基因序列与NCBI数据库GenBank的序列进行相似性比较并构建系统发育树。实验中从8种珊瑚表面和内部共分离得到97株菌落形态各异的真菌。ITS-rDNA序列分析及形态学鉴定表明,珊瑚共附生真菌主要包括曲霉菌Aspergillus sp.、枝孢霉菌Cladosporium sp.、炭角菌Xylariales sp.、青霉菌Penicillium sp.、葡萄穗霉菌Stachybotrys sp.、赤霉菌Gibberella moniliformis、镰刀霉菌Fusarium sp.等。分离得到的菌株中,4-13与GenBank中已报道的基因序列的相似性仅为89%,可能是潜在的新属种。选取04丛生盔形珊瑚（Galaxea fascicularis）共附生可培养真菌进行抑菌活性和酶抑制活性筛选。采用96孔板培养法结合酶标仪测定。以6种常见的致病菌或致食品腐败的细菌为指示菌,对其共附生真菌次级代谢产物进行抗菌活性筛选,对抗菌能力及抗菌谱进行研究。结果表明:19株真菌均具有不同程度的抗菌活性。高活性菌株占52.63%,其中4-4、4-5两菌株表现出良好的抗菌活性。在酶抑制性实验中,有10株真菌对一种或两种酶具有抑制活性,其中曲霉属真菌效果良好,散囊属真菌4-12、枝孢霉4-20对乙酰胆碱酯酶的抑制效果超过了阳性对照石杉碱甲。粗提物样品对α-葡萄糖苷酶、乙酰胆碱酯酶有较好的抑制活性,说明具有抗老年痴呆、抗高血压活性。这对新药的研究开发提供了一定的理论基础,具有进一步的研究价值。结果表明,珊瑚共附生可培养真菌多样性较为丰富,潜在新的微生物菌种资源,并具有较好的生物活性,因此珊瑚共附生真菌具有良好的应用潜力和综合开发前景。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 海洋真菌研究概况
• 1.1.1 海洋真菌的定义及其多样性
• 1.1.2 微生物群落多样性的研究方法
• 1.1.3 海洋真菌活性物质
• 1.1.4 海洋微生物活性物质的筛选
• 1.2 珊瑚及珊瑚共附生真菌
• 1.2.1 珊瑚生物学特性
• 1.2.2 珊瑚共附生微生物
• 1.3 本课题主要研究内容
• 1.3.1 研究目的和意义
• 1.3.2 主要技术路线
• 2 珊瑚共附生真菌的分离及形态学观察
• 2.1 材料
• 2.1.1 样品来源
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 海水
• 2.2 主要实验仪器与设备
• 2.3 实验方法
• 2.3.1 样品处理方法
• 2.3.2 珊瑚共附生真菌分离
• 2.3.3 菌株保存
• 2.3.4 样品编号
• 2.3.5 珊瑚共附生真菌形态学观察
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 珊瑚共附生真菌的分离
• 2.4.2 不同培养基上珊瑚共附生真菌的分离
• 2.4.3 样品中珊瑚共附生真菌的分布及种属
• 2.4.4 形态学观察
• 2.5 小结与讨论
• 2.5.1 本章小结
• 2.5.2 讨论
• 3 04 丛生盔型珊瑚共附生真菌的ITS 序列分析
• 3.1 材料
• 3.1.1 菌株来源
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 主要仪器
• 3.3 实验方法
• 3.3.1 DNA 提取
• 3.3.2 扩增ITS-rDNA 的引物
• 3.3.3 ITS-rDNA 扩增
• 3.3.4 PCR 产物检测
• 3.3.5 ITS-rDNA 序列分析
• 3.3.6 种群多样性分析
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 ITS 扩增产物的电泳图谱
• 3.4.2 丛生盔型珊瑚共附生真菌的多样性分析
• 3.4.3 丛生盔型珊瑚共附生真菌的系统发育学分析
• 3.5 小结与讨论
• 3.5.1 本章小结
• 3.5.2 讨论
• 4 04 丛生盔型珊瑚共附生真菌发酵粗提物生物活性筛选
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌株来源
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 指示菌
• 4.1.4 主要试剂
• 4.2 主要仪器
• 4.3 实验方法
• 4.3.1 珊瑚共附生真菌次级代谢产物粗提物制备
• 4.3.2 抑菌实验
• 4.3.3 酶抑制性实验
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 抗菌活性菌株初筛选
• 4.4.2 活性菌株的抗菌能力比较
• 4.4.3 粗提物的酶抑制活性
• 4.5 小结与讨论
• 4.5.1 本章小结
• 4.5.2 讨论
• 5 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 附录：构建系统发育树的19 株菌株的ITS 测序序列
• 致谢
• 作者简历
• 导师简介