一粒小麦籽粒硬度基因Pina~m，Pinb~m，Gsp~m相关载体的构建及遗传转化

论文摘要

籽粒硬度对谷物的加工品质具有重要影响，在众多的小麦族植物（尤其是小麦）中，籽粒的硬度性状主要由5D短臂上的Hardness（Ha）位点的两个主效基因，即Puroindoline a（Pina-D1）和Puroindoline b（Pinb-D1）控制，同时受基因Grain SoftnessProtein-1（Gsp-1）的影响。这三个基因所表达的蛋白（friabilin）分散在小麦胚乳内，它与淀粉粒表面的脂质相互作用影响着籽粒的硬度。本研究以一粒小麦（T. monococcum）DV92作为Pinam、Pinbm和Gspm基因的供体，构建了相关的表达载体5个；诱导普通小麦品种“科农199”成熟胚愈伤16909个和幼胚愈伤11081个用于基因枪介导的遗传转化；经Biolaphos（化学除草剂）筛选获得抗性植株；再经PCR检测获得阳性植株。主要研究结果如下：（1）相关表达载体的构建：以一粒小麦DV92基因组DNA为模板，用pGEM构建完成了单基因表达载体pGEM-pinam、pGEM-pinbm、pGEM-gspm；两基因串联表达载体pGEM-pinam-pinbm；以及三基因串联表达载体pGEM-Pinam-Pinbm-Gspm。（2）遗传转化：通过组织培养获得“科农199”成熟胚愈伤16909个，其中13199个愈伤用于基因枪轰击转化两基因串联表达载体pGEM-pinam-pinbm；幼胚愈伤10130个，其中4522个愈伤基因枪轰击转化两基因串联表达载体pGEM-pinam-pinbm,5608个愈伤基因枪轰击转化三基因串联表达载体pGEM-Pinam-Pinbm-Gspm。（3）抗性筛选：基因枪轰击的5608个小麦幼胚愈伤，经Biolaphos（化学除草剂）抗性筛选，最终获得933株再生植株（本研究只对后期所培养的部分幼胚分化所得抗性苗进行了检测）。（4）PCR检测：再生植株中鉴定出11株阳性植株，有关转基因植株的籽粒硬度还需进一步实验验证。本研究将Pinam、Pinbm和Gspm三个软粒基因串联连接到表达载体上，并将其转化到硬质普通小麦品种“科农199”中，实现了三基因共同转化普通小麦，克服多个单基因逐个转化时选择标记替换使用问题，减少组织培养、遗传转化和DNA提取的工作量。实现了软粒基因在普通小麦中的遗传转化，为利用基因枪介导的遗传转化方法改良小麦提供了可行性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1. 前言
• 1.1 软粒基因的研究进展
• 1.1.1 小麦软粒基因的组成
• 1.1.2 Puroindoline 基因
• 1.1.2.1 Puroindoline 的基因结构
• 1.1.2.2 Puroindoline 蛋白分子的生化特点
• 1.1.2.3 小麦中的 Puroindoline 基因（Pin）的基本遗传特性
• 1.1.3 Gsp-1 基因
• 1.1.3.1 Gsp-1 基因的结构
• 1.1.3.2 Gsp-1 蛋白分子的生化特点
• 1.1.4 其它谷类物种中的 Puroindoline，Gsp-1 的同源基因
• 1.1.4.1 其它谷类物种中的 Puroindoline 的同源基因
• 1.1.4.2 其它谷类中的 Gsp-1 的同源基因
• 1.1.5 普通小麦 Puroindoline 的突变类型
• 1.1.6 其它类 Puroindoline 的多态性
• 1.2 植物转基因技术的研究进展
• 1.2.1 植物转基因技术概述
• 1.2.2 愈伤组织再生系统
• 1.2.3 遗传转化方法
• 1.2.3.1 离体组织农杆菌转化法及其应用
• 1.2.3.2 基因枪转化法及其应用
• 1.2.3.3 花粉管通道法
• 1.2.3.4 其他遗传转化方法
• 1.3 本研究的目的与意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 基因供体和受体
• 2.1.2 引物
• 2.1.3 生化试剂
• 2.1.4 克隆菌株及质粒载体
• 2.1.5 主要仪器设备
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 各表达载体的构建
• 2.2.2 基因枪转化
• 2.2.3 转基因植株的 PCR 检测
• 3. 结果与分析
• m，Pinb^m，Gsp-1^m表达载体的构建'>3.1 Pina^m，Pinb^m，Gsp-1^m表达载体的构建
• m，Pinb^m，Gsp-1^m各单基因克隆载体的构建'>3.1.1 Pina^m，Pinb^m，Gsp-1^m各单基因克隆载体的构建
• m、pGEM-pinb^m、pGEM-gsp^m的构建'>3.1.2 各单基因表达载体 pGEM-pina^m、pGEM-pinb^m、pGEM-gsp^m的构建
• m-pinb^m的构建及酶切检测'>3.1.3 两基因串联表达载体 pGEM-pina^m-pinb^m的构建及酶切检测
• m-Pinb^m-Gsp^m的构建及酶切检测'>3.1.4 三基因串联的表达载体 pGEM-Pina^m-Pinb^m-Gsp^m的构建及酶切检测
• 3.2 基因枪介导的串联基因小麦遗传转化
• 3.3 转基因后代的筛选鉴定
• 4. 讨论
• 参考文献
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表的论文