Pim-3对急性肝损伤肝细胞凋亡的抑制作用

论文摘要

目的运用流体力学基因转染方法,将已克隆的Pim-3基因转染进入大鼠的肝脏内并用LPS/D-GalN诱导急性肝损伤,观察转染后Bcl-2、p53等基因的表达变化及对肝细胞生长的影响。探讨Pim-3基因对急性肝损伤肝细胞凋亡的抑制作用及其机制。方法32只大鼠随机分成四组（8只/组）。A组为正常对照组,B、C和D组分别以林格氏液、空载质粒和Pim-3基因重组质粒溶液预处理大鼠,1天后给予LPS/D-GalN腹腔内注射诱导急性肝损伤,8h后或濒死期处死大鼠,采集肝组织标本。利用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白（GFP）表达水平;TUNEL分析检测细胞凋亡情况,并用底物显色法检测Caspase-3活性;肝组织基因表达通过RT-PCR和Western blot进行检测。结果1.固定后的肝组织冰冻切片在荧光显微镜下观察,C组和D组肝组织有大量GFP表达,而A组和B组则无GFP表达,表明质粒成功转染进入肝组织内,并在肝组织内出现高表达。2.肝组织TUNEL分析各组大鼠肝细胞凋亡指数（AI）,分别为:A组3.1%±1.7%、B组83.1%±12.6%、C组79.9%±13.4%和D组10.2%±6.9%,所有受LPS/D-GalN攻击的处理组大鼠肝组织的细胞凋亡指数均明显高于正常对照组,且B组和C组凋亡指数显著高于D组（P<0.01）,B组和C组间比较,差异无统计学意义（P>0.05）,提示Pim-3基因的活体内转染可显著减轻LPS/D-GalN诱导的肝细胞凋亡。3.肝组织Caspase-3活性测定显示各组大鼠分别为:A组107.1±75.0 pmol/min.mg、B组728.8±185.8 pmol/min.mg、C组643.5±242.9 pmol/min.mg和D组250.1±84.3 pmol/min.mg,所有LPS/D-GalN攻击大鼠Caspase-3活性明显高于正常对照组,B组和C组显著高于D组（P<0.01）,而B组和C组间差异无明显统计学意义（P>0.05）,提示内毒素攻击诱导了大鼠肝组织Caspase-3的活性,而Pim-3基因的转染则抑制了其活性。4.各组大鼠肝组织Pim-3 mRNA的相对表达水平分别为:A组0.29±0.12、B组0.10±0.03、C组0.16±0.11和D组0.63±0.18;Pim-3蛋白质的相对表达水平分别为:A组1.12±0.56、B组0.61±0.48、C组0.37±0.29和D组2.52±0.62,D组mRNA和蛋白质表达水平较A、B和C三组高（P<0.05）,A组表达水平较B、C组高（P<0.05）,B组和C组间则差异无统计学意义（P>0.05）,提示正常大鼠肝组织有Pim-3基因表达,LPS/D-GalN的应用可显著抑制其表达,外源基因的转染则可引起Pim-3基因高表达。5.各组大鼠肝组织Bcl-2 mRNA的相对表达水平分别为:A组0.26±0.06、B组0.32±0.11、C组0.28±0.09和D组0.86±0.14;Bcl-2蛋白质相对表达水平分别为:A组0.91±0.22、B组0.85±0.19、C组0.84±0.23和D组1.93±0.76,D组mRNA和蛋白质表达水平较A、B和C三组高（P<0.01）,而A、B和C三组间比较差异无统计学意义（P>0.05）,提示Pim-3基因的应用促进了Bcl-2的表达。6.各组大鼠肝组织p53 mRNA的相对表达水平分别为:A组0.57±0.38、B组1.17±0.71、C组1.23±0.85和D组0.22±0.16,D组p53表达水平低于A组、B和C组（P<0.05）,A组低于B和C组（P<0.05）,但B和C组间差异无统计学意义（P>0.05）,提示内毒素攻击诱导了大鼠肝组织p53高表达,Pim-3基因转染则抑制了其表达。结论Pim-3基因能抑制Caspase-3的活性、抑制p53的表达、促进Bcl-2的表达,并抑制肝细胞的凋亡。外源性Pim-3基因的活体内转染可以有效地抑制的肝细胞凋亡,从而保护大鼠免于LPS/D-GalN诱导的急性肝损伤的发生。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 引言
• 第2章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 实验动物
• 2.1.2 质粒来源
• 2.1.3 主要仪器与设备
• 2.1.4 主要试剂
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 实验动物
• 2.2.1.1 动物饲养
• 2.2.1.2 动物分组及处理方法
• 2.2.2 建立急性肝损伤动物模型
• 2.2.3 基因转染方法
• 2.2.3.1 质粒的提取
• 2.2.3.2 靶向肝脏的活体基因转染
• 2.2.4 荧光显微镜检查
• 2.2.5 细胞凋亡的TUNEL 分析
• 2.2.6 Caspase-3 活性检测
• 2.2.7 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
• 2.2.7.1 RNA 的提取
• 2.2.7.2 逆转录即cDNA 的合成
• 2.2.7.3 PCR 扩增
• 2.2.8 蛋白免疫印迹（Western blot）检测
• 2.2.8.1 常用液体的配制
• 2.2.8.2 样本总蛋白提取和浓度测定
• 2.2.8.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.8.4 Western 印迹法
• 2.3 统计学分析
• 第3章 结果
• 3.1 各组大鼠肝组织GFP 表达情况
• 3.2 肝组织目的基因Pim-3 的表达
• 3.3 肝细胞凋亡的TUNEL 分析结果
• 3.4 肝组织Caspase-3 活性分析结果
• 3.5 肝组织Bcl-2 基因的表达
• 3.6 肝组织凋亡诱导基因p53 的表达
• 第4章 讨论
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 进一步工作的方向
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 肝炎病毒与原癌基因的激活
• 附录B 胚胎干细胞与 Nanog 基因
• 攻读硕士学位期间的研究成果