趋化因子受体CXCR4对骨肉瘤细胞株肺转移的影响

论文摘要

骨肉瘤是最常见的原发性恶性骨肿瘤,肺部是其发生远处转移最主要的部位,约占所有转移的90%,约85%的患者就诊时就存在不同程度的肺部转移灶,是骨肉瘤患者的主要死因。因此,骨肉瘤肺转移的研究对改善预后和提高生存率至关重要。目前,骨肉瘤的研究较多,但骨肉瘤特异性肺转移的分子机制的研究则较少。趋化因子受体CXCR4（Chemokine receptor 4）是基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1,SDF-1）的受体,是一个高度保守的G蛋白偶联七次跨膜受体。近几年的研究显示SDF-1/CXCR4生物学轴在乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌和血液系统恶性肿瘤的器官特异性转移中发挥着重要的驱动、导向和定位作用,但CXCR4在骨肉瘤肺转移中作用的研究则很少。第一部分CXCR4在骨肉瘤组织中的表达及意义目的研究趋化因子受体CXCR4的表达水平与骨肉瘤肺转移的关系,探讨CXCR4在骨肉瘤组织中表达的临床意义。方法采用免疫组化法测定5例胸片发现肺部明显肿块（高疑肺转移）及11例胸片未见肺部肿块的骨肉瘤患者的原发灶组织中CXCR4的表达水平。结果CXCR4在16例骨肉瘤组织中均有表达,但肺部有明显肿块（高疑肺转移）的骨肉瘤组织中CXCR4的表达水平（80.52±9.93）明显高于肺部未见明显肿块的骨肉瘤组织（65.56±12.75）,有显著性差异,P＜0.05。结论肺部有明显肿块（高疑肺转移）的骨肉瘤组织中CXCR4的表达水平显著增高,提示CXCR4可能参与了骨肉瘤的肺转移,为进一步的研究提供线索。第二部分骨肉瘤细胞株CXCR4的表达水平与体外侵袭能力的相关性研究目的探讨趋化因子受体CXCR4对骨肉瘤细胞株的体外侵袭能力的影响。方法采用有限稀释法,从人骨肉瘤细胞系MG—63中分离培养出细胞株,用免疫组化的方法挑选出高表达和低表达CXCR4蛋白的细胞株各一株,用RT—PCR的方法进一步检测其CXCR4 mRNA的表达情况,然后采用transwell侵袭实验观察细胞株的体外侵袭和转移能力及CXCR4特异性抗体对其侵袭和转移能力的影响。结果①获得并挑选出CXCR4蛋白高表达（B8）和低表达（G5）的骨肉瘤细胞株各一株;②CXCR4蛋白高表达的骨肉瘤细胞株的表达水平（94.74±17.35,B8）明显高于低表达的骨肉瘤细胞株（41.86±6.54,G5）,有显著性差异,P＜0.01;③B8细胞株中CXCR4mRNA的表达水平（1.37±0.36）明显高于G5细胞株（0.44±0.13）,有显著性差异,P＜0.01;④B8细胞株的穿膜细胞数（53.60±15.37）明显多于G5细胞株（19.60±8.20）,有显著性差异,P＜0.01;⑤CXCR4特异性抗体干预后的穿膜细胞数（21.80±8.53）明显少于干预前（53.60±15.37）,有显著性差异,P＜0.01;⑥细胞株中CXCR4蛋白的表达水平与其体外侵袭能力呈正相关,有统计学意义,P＜0.01;⑦细胞株中CXCR4 mRNA的表达水平与其体外侵袭能力呈正相关,有统计学意义,P＜0.05。结论在国内首次发现高表达CXCR4蛋白、CXCR4 mRNA的骨肉瘤细胞容易发生体外的侵袭和转移,而这种体外的侵袭和转移反应可被CXCR4特异性抗体抑制,提示CXCR4在骨肉瘤细胞的体外侵袭和转移中发挥着重要作用。第三部分小干扰RNA对骨肉瘤细胞株CXCR4基因表达和侵袭力的影响目的研究小干扰RNA（siRNA）对骨肉瘤细胞株中趋化因子受体CXCR4基因表达和体外侵袭能力的影响。方法设计及化学合成针对CXCR4基因的特异性siRNA,采用脂质体法转染高表达CXCR4 mRNA的骨肉瘤细胞株,转染后采用RT-PCR的方法检测CXCR4基因表达水平的变化,并采用transwell侵袭实验观察其体外侵袭能力的变化。结果①成功地设计和合成了针对CXCR4基因的特异性siRNA;②顺利地将CXCR4 siRNA转染入高表达CXCR4 mRNA的骨肉瘤细胞株,其转染效率为43.82±3.02%;③转染后CXCR4 mRNA的表达水平（0.41±0.05）明显低于阴性对照组（0.75±0.08）和空白组（0.72±0.08）,有显著性差异,P＜0.01;④转染后穿过侵袭膜的细胞数（31.20±7.1）明显少于转染前的细胞数（53.60±15.37）,有显著性差异,P＜0.01。结论①成功地合成了CXCR4 siRNA并将其转染入骨肉瘤细胞;②在国内首次发现CXCR4 siRNA能下调骨肉瘤细胞CXCR4基因的表达水平和抑制其体外侵袭能力,提示CXCR4在骨肉瘤细胞的体外侵袭和转移中发挥着重要作用,为利用siRNA防治骨肉瘤的转移奠定了理论基础。第四部分CXCR4对骨肉瘤细胞株的裸鼠肺转移的影响目的研究趋化因子受体CXCR4对骨肉瘤细胞株的裸鼠体内肺转移的影响。方法将高表达和低表达CXCR4蛋白、CXCR4 mRNA的骨肉瘤细胞株分别接种于裸鼠的颈背部皮下并于4周后处死裸鼠,观察其肺部的转移情况并分级。结果①高表达CXCR4蛋白、CXCR4 mRNA的骨肉瘤细胞株的裸鼠肺转移灶的级数（84.40±14.79）大于低表达的骨肉瘤细胞株（32.00±8.00）,有显著性差异,P＜0.01;②细胞株中CXCR4蛋白的表达水平与裸鼠体内肺转移能力呈正相关,有统计学意义,P＜0.01;③细胞株中CXCR4 mRNA的表达水平与裸鼠体内肺转移能力呈正相关,有统计学意义,P＜0.05。结论在国内首次发现高表达CXCR4蛋白、CXCR4 mRNA的骨肉瘤细胞在裸鼠体内容易发生肺转移,提示CXCR4在骨肉瘤细胞的裸鼠体内肺转移过程中发挥着重要作用。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩略词
• 第一章 CXCR4在骨肉瘤组织中的表达及意义
• 1.1 前言
• 1.2 材料与方法
• 1.3 结果
• 1.4 讨论
• 1.5 结论
• 第二章 骨肉瘤细胞株CXCR4的表达水平与体外侵袭能力的相关性研究
• 2.1 前言
• 2.2 材料与方法
• 2.3 结果
• 2.4 讨论
• 2.5 结论
• 第三章 小干扰RNA对骨肉瘤细胞株CXCR4基因表达和侵袭力的影响
• 3.1 前言
• 3.2 材料与方法
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.5 结论
• 第四章 CXCR4对骨肉瘤细胞株的裸鼠肺转移的影响
• 4.1 前言
• 4.2 材料与方法
• 4.3 结果
• 4.4 讨论
• 4.5 结论
• 附录
• 参考文献
• 综述一
• 综述二
• 致谢
• 攻读学位期间主要的科研成果