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酵母催化不对称还原2’-氯-苯乙酮及相关酶的克隆表达

2020-11-29阅读(619)

酵母催化不对称还原2’-氯-苯乙酮及相关酶的克隆表达

论文摘要

手性化合物由于其独特的光学活性，广泛应用于医药、食品、化工、农药等领域，随着对不同光学异构体药物药理作用的研究进展和对外消旋药物申报和使用的种种限制，手性药物成为近年来研究的热点和方向。光学纯醇类化合物是手性药物合成的重要中间体。利用微生物或其细胞内的氧化还原酶催化潜手性酮的不对称还原已成为制备高光学纯度手性醇的重要方法。本文以2’-氯-苯乙酮作为模型底物，研究了水相中酵母全细胞催化芳香酮类化合物不对称还原反应的特性，并通过条件优化提高了反应效率，强化了反应过程。从酵母细胞内分离纯化出具有不对称催化能力的氧化还原酶——羰基还原酶（CAR），并通过基因重组技术，构建了能有效表达羰基还原酶基因的重组大肠杆菌。在重组CAR不对称还原2’-氯-苯乙酮的过程中，通过底物耦联体系，成功地实现了辅酶NADH的原位再生。工作的主要内容包括：（1）从实验室保存的七株酵母菌株中筛选出高效高选择性还原2’-氯-苯乙酮为（S）-2’-氯-苯乙醇的酵母Candida pseudotropicalis 104（C．104）。研究了助溶剂乙醇含量对酵母还原产率的影响，比较了不同的水／有机溶剂两相反应体系中的还原效率，最后选择了无助溶剂的单一水相中酵母细胞催化还原高浓度2’-氯-苯乙酮作为反应体系。不溶性底物在振荡的状态下呈微小液滴状分散于缓冲液中。在加入20g/L的葡萄糖作为辅助底物时，20 gDCW（dry cell weight，细胞干重）／L的酵母可将19．48 mmol／L的2’-氯-苯乙酮完全转化，反应初速度达到33．27 mmol／（h·gDCW），反应体系中的b／s（生物催化剂与底物质量之比：酵母细胞干重gDCW／底物质量g）值为6.7。酵母细胞在短时间内可耐受高达233．8 mmol／L（约36g/L）。的底物浓度，反应24小时产物浓度可达58．4 mmol／L。24小时以后，高浓度的底物和产物均会令酵母细胞失去活性甚至死亡。但在较低底物浓度（6．49 mmol／L）条件下，酵母细胞的耐受性提高，可以多次重复使用，使用16次以后产率仍能达到100％。（2）对酵母细胞进行超声波破碎，提取出粗酶液，经过DEAE离子交换层析和Blue sepharose蓝色琼脂糖亲和层析分离后，获得了电泳纯的的羰基还原酶（CAR）。最终酶活回收达到22．4％，比活力为15．8 U／mgPr，纯化倍数为2980倍。纯化的CAR表现出了比酵母细胞更高的催化选择性，产物S构型2’-氯-苯乙醇的对映体过剩（e．e．）值达到100％。（3）对纯化的羰基还原酶的酶学性质作了研究，该酶以NAD（H）为辅酶，可以不对称催化酮的还原及相应醇的氧化反应。酶的最适温度为50℃，催化氧化反应的最适pH为8．5，催化还原反应的最适pH在6．0到6．5之间。CAR的热稳定性较差，在30℃以上时酶蛋白迅速变性失活；酶蛋白对环境pH的变化比较敏感，仅在pH值7．0至8．5之间较为稳定。多数金属离子对酶催化具有抑制作用，EDTA的加入对酶活的影响不明显。CAR具有广泛的底物特异性，可以催化还原多种芳香族和脂肪族酮类化合物，以及相应醇类的氧化反应。反应结果显示，羰基还原酶对还原底物的活力大小受到羰基附近位阻效应和电荷诱导效应的双重影响，但以位阻效应为主要影响因素。羰基还原酶对芳香酮类化合物具有很高的立体选择性，对苯乙酮、2’-氯-苯乙酮、3’-氯-苯乙酮、4’-氯-苯乙酮、3-氯-1-苯丙酮和2-氯-2’，4’-二氟苯乙酮还原产物的e．e．值都达到100％，其反应方式遵循Prelog反应规则。（4）从酵母C．104中成功扩增得到CAR基因片断，连接到表达质粒pET28a（+）中，构建得到重组菌Ecoli BL21（DE3）（pET28a-CAR）。经过IPTG诱导表达，其比活达到0．24 U／mgPr，为酵母C．104（0．0053 U／mgpr）的40多倍。利用Ni-NTA Agarose亲和层析，从重组菌E．coli BL21（DE3）（pET28a-CAR）中纯化出了重组CAR，重组CAR与酵母细胞中分离出的CAR具有相同的酶学性质。用相同的引物分别从酵母Saccharomyces cerevisiae B5、Candida utilis 1257、Pichia membranaefaciens和Saccharomyces cerevisiae 4742中扩增出与CAR基因序列相同的基因片段，说明CAR基因在多种酵母细胞中存在，具有高度的保守性。（5）应用重组CAR不对称催化还原2’-氯-苯乙酮，通过加入异丙醇或仲丁醇作为辅助底物，建立了底物耦联反应体系实现辅酶NADH原位再生的反应体系。对反应条件和反应的动力学作了研究：反应的最适温度为30℃，最适pH为7．0，CAR催化还原2’-氯-苯乙酮的动力学参数：Km=0．693 mmol／L，Vmax=0．017μmol／min（[NADH]：0．06mmol／L）。根据反应平衡动力学，推导出底物耦联反应的平衡公式（仲丁醇为辅助底物）为Keql·Keq2=[P][butone]/[S][2-butanol]。

论文目录

  • 摘要
  • Abstract
  • 目录
  • 第一章 绪论
  • 1.1 手性药物概述
  • 1.1.1 手性药物的药理立体选择性
  • 1.1.2 手性药物制剂的市场发展
  • 1.2 手性醇在制药领域的应用及其合成
  • 1.2.1 手性醇在制药领域的应用
  • 1.2.2 生产手性醇的方法
  • 1.3 微生物法不对称还原合成手性醇
  • 1.3.1 微生物转化在手性药物合成中的应用
  • 1.3.2 微生物不对称还原的特点
  • 1.3.3 应用于不对称还原的微生物种类
  • 1.3.4 控制反应立体选择性的主要方法
  • 1.3.5 提高反应体系中底物转化量的方法
  • 1.4 酶法不对称还原合成手性醇
  • 1.4.1 应用于不对称还原的氧化还原酶
  • 1.4.2 酶不对称还原羰基化合物的机理
  • 1.4.4 氧化还原酶的分离纯化
  • 1.5 还原体系中的辅酶再生
  • 1.5.1 化学法
  • 1.5.2 电化学法
  • 1.5.3 光化学法
  • 1.5.4 生物法
  • 1.6 本课题的研究思路和主要内容
  • 参考文献
  • 第二章 酵母细胞不对称还原2’-氯-苯乙酮
  • 2.1 引言
  • 2.2 材料与方法
  • 2.2.1 菌种与培养基
  • 2.2.2 试剂
  • 2.2.3 主要实验仪器
  • 2.2.4 静息细胞的制备
  • 2.2.5 不对称还原反应
  • 2.2.6 产物分析
  • 2.2.7 数据处理
  • 2.3 结果与讨论
  • 2.3.1 酵母菌的筛选
  • 2.3.2 反应体系中乙醇含量对产率的影响
  • 2.3.3 不同水-有机溶剂双相反应体系中酵母还原2’-氯-苯乙酮的比较
  • 2.3.4 添加不同的辅助底物对反应的影响
  • 2.3.5 底物浓度和外加消旋产物对反应的影响
  • 2.3.6 酵母细胞还原2’-氯苯乙酮的过程曲线
  • 2.3.7 细胞用量对还原反应的影响
  • 2.3.8 酵母细胞的重复利用
  • 2.4 小结
  • 参考文献
  • 第三章 酵母Candida pseudotropicalis 104羰基还原酶的分离纯化
  • 3.1 引言
  • 3.2 材料与方法
  • 3.2.1 菌种与培养条件
  • 3.2.2 试剂
  • 3.2.3 主要实验仪器
  • 3.2.4 羰基还原酶的分离纯化
  • 3.2.5 纯化产物的分析
  • 3.2.6 酶活及蛋白含量的测定
  • 3.2.7 不对称还原及产物分析
  • 3.2.8 数据处理
  • 3.3 结果与讨论
  • 3.3.1 羰基还原酶（CAR）的分布位置及辅酶依赖性的确定
  • 3.3.2 DEAE阴离子交换层析
  • 3.3.3 Blue Sepharose 6 FF亲和层析
  • 3.3.4 羰基还原酶的纯化结果
  • 3.3.5 羰基还原酶不对称催化还原2’-氯-苯乙酮及产物分析
  • 3.3.6 羰基还原酶肽质量图谱分析结果
  • 3.4 小结
  • 参考文献
  • 第四章 羰基还原酶酶学性质的研究
  • 4.1 引言
  • 4.2 材料与方法
  • 4.2.1 菌种与培养条件
  • 4.2.2 试剂
  • 4.2.3 主要实验仪器
  • 4.2.4.羰基还原酶的制备
  • 4.2.5 酶活的测定
  • 4.2.6 酶反应的最适温度及温度稳定性的测定
  • 4.2.7 酶反应的最适pH及pH稳定性
  • 4.2.8 金属离子对酶反应的影响
  • 4.2.9 酶反应的底物特异性
  • 4.2.10 不对称催化过程
  • 4.2.11 产物构型分析
  • 4.2.12 数据处理
  • 4.3 结果与讨论
  • 4.3.1 羰基还原酶催化反应的可逆性
  • 4.3.2 羰基还原酶的最适催化温度及温度稳定性
  • 4.3.3 羰基还原酶催化反应的最适pH及pH稳定性
  • 4.3.4 金属离子及EDTA对羰基还原酶酶活的影响
  • 4.3.5 羰基还原酶的底物专一性
  • 4.3.6 羰基还原酶与酵母全细胞对部分芳香酮还原的立体选择性比较
  • 4.4 小结
  • 参考文献
  • 第五章 羰基还原酶基因的克隆与表达
  • 5.1 引言
  • 5.2 材料与方法
  • 5.2.1 菌种、质粒与培养条件
  • 5.2.2 酶与化学试剂
  • 5.2.3 主要实验仪器
  • 5.2.4 羰基还原酶基因的克隆与表达质粒的构建
  • 5.2.5 重组大肠杆菌的培养及酶蛋白的表达
  • 5.2.6 酶活及蛋白含量的测定
  • 5.2.7 重组羰基还原酶的纯化及分析
  • 5.2.8 不对称还原及产物分析
  • 5.2.9 数据处理
  • 5.3 结果与讨论
  • 5.3.1 CAR基因克隆与表达质粒构建结果
  • 5.3.2 不同的重组菌与原始酵母C.104表达活力的比较
  • 5.3.3 重组CAR的纯化
  • 5.3.4 表达温度及时间对CAR的表达及活力的影响
  • 5.3.5 诱导剂IPTG的浓度对CAR表达及活力的影响
  • 5.3.6 诱导时间对CAR表达及活力的影响
  • 5.4 小结
  • 参考文献
  • 第六章 重组羰基还原酶不对称还原2’-氯-苯乙酮
  • 6.1 引言
  • 6.2 材料与方法
  • 6.2.1 菌株与培养条件
  • 6.2.2 试剂
  • 6.2.3 实验仪器
  • 6.2.4 酶活的测定
  • 6.2.5 重组菌的培养及粗酶液的制备
  • 6.2.6 不对称还原反应体系
  • 6.2.7 产物分析
  • 6.2.8 数据处理
  • 6.3 结果与讨论
  • 6.3.1 不同共底物对重组菌细胞催化转化2’-氯-苯乙酮产率的影响
  • 6.3.2 重组菌全细胞与粗酶液体系中还原2’-氯-苯乙酮的结果
  • 6.3.3 异丙醇与仲丁醇含量对还原反应的影响
  • 6.3.4 反应体系中NADH/NAD+的含量对还原产率的影响
  • 6.3.5 反应体系中最适pH的确定
  • 6.3.6 温度对重组CAR还原2’-氯-苯乙酮的影响
  • 6.3.7 底物浓度对还原反应的影响
  • 6.3.8 CAR的用量对还原反应的影响
  • 6.3.9 重组CAR不对称催化氧化还原反应动力学性质
  • 6.4 小结
  • 参考文献
  • 第七章 结论和展望
  • 7.1 结论
  • 7.2 建议和展望
  • 攻读博士学位期间主要成果
  • 致谢

    • 相关论文文献

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